(南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所，湖南省特殊病原體防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省分子靶向新藥研究合作創(chuàng)新中心，湖南 衡陽 421001)

肝纖維化是血吸蟲病最嚴(yán)重的免疫病理損害[1-2]。巨噬細(xì)胞的極化在纖維化形成和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，日本血吸蟲體表特異性結(jié)合短肽ZLW[3]，可降低SmAP 酶活性[4-5]，抑制肝纖維化，干預(yù)宿主巨噬細(xì)胞的極化。本實(shí)驗(yàn)力圖通過研究ZLW-SmAP-腺苷三者之間的關(guān)系，驗(yàn)證ZLW干預(yù)宿主巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；ZLW多肽由浙江昂拓萊司生物技術(shù)有限公司合成；陽性釘螺購于岳陽市血吸蟲病防治所；昆明小鼠購于同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；腺苷ELISA檢測(cè)試劑盒購于上海江萊生物有限公司；qRT-PCR試劑盒購于天根生化有限公司；引物由上海生工有限公司合成；全自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀為BIO-TEK美國寶特公司；凝膠圖像分析系統(tǒng)為BIO-RAD美國伯樂公司；熒光定量PCR儀為瑞士羅氏生物有限公司。

1.2 日本血吸蟲堿性磷酸酶的分離

根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]，略加改進(jìn)，利用正丁醇-硫酸銨法提取蟲體堿性磷酸酶：日本血吸蟲常規(guī)感染小鼠取蟲體1 g，洗滌后，加入3 mL 0.05 mol/LTris-HCl勻漿l min，4 ℃過夜后加入預(yù)冷的正丁醇0.6 mL，37 ℃保溫30 min后，放置冰箱內(nèi)10 h，室溫下離心 4 000 r/15 min，取上清；在其上清液中加入硫酸銨，取0.35 ～0.70飽和度鹽析物，溶于0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)中，充分透析后離心；用0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)洗脫，每管收集1 mL； BCA法檢測(cè)蛋白濃度，并檢測(cè)其酶活。

1.3 ELISA檢測(cè)各刺激因子最佳濃度

將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104，接種在24孔板內(nèi)，加入不同濃度梯度的單磷酸腺苷(1.5 mmol/L、2 mmol/L、2.5 mmol/L、3 mmol/L)，培養(yǎng)24 h，收集上清，ELISA檢測(cè)iNOS以及Arg1的OD值，明確其最佳濃度；將最佳濃度的單磷酸腺苷與不同濃度梯度的堿性磷酸酶(0.9 mmol/L、1 mmol/L、1.1 mmol/L、1.2 mmol/L)共同培養(yǎng)細(xì)胞，同法檢測(cè)堿性磷酸酶最佳濃度；最佳濃度的堿性磷酸酶、單磷酸腺苷與不同濃度梯度的多肽(0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L)共同培養(yǎng)細(xì)胞，檢測(cè)多肽的最佳濃度。

根據(jù)單磷酸腺苷、堿性磷酸酶及多肽的最佳濃度，ELISA分別測(cè)定A2a受體抑制劑、A2a受體激動(dòng)劑、A2b受體抑制劑及A2b受體激動(dòng)劑等各刺激因子的最佳濃度。

1.4 干預(yù)分組

調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于24孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%時(shí)，加入最佳濃度的刺激因子進(jìn)行孵育。實(shí)驗(yàn)分組為：堿性磷酸酶+單磷酸腺苷+多肽組、堿性磷酸酶+單磷酸腺苷+多肽+A2a受體抑制劑組、堿性磷酸酶+單磷酸腺苷+多肽+A2a受體激動(dòng)劑組、堿性磷酸酶+單磷酸腺苷+多肽+A2b受體抑制劑組 、堿性磷酸酶+單磷酸腺苷+多肽+A2b受體激動(dòng)劑組，分別設(shè)置對(duì)照組。

1.5 Western blot檢測(cè)一氧化氮合酶和精氨酸酶1的蛋白表達(dá)水平

各實(shí)驗(yàn)組干預(yù)24 h后，TBS洗滌三遍，加入裂解液80 μL，裂解30 min，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下來，4 ℃12 000 r/5min。吸取上清保存。取上述40 μL樣品，按4∶1比例與5×SDS 上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸后變性10 min。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜，恒流0.05A，時(shí)間為40 min，將膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜成功后，用含有5%脫脂奶粉的封閉液，4 ℃封閉過夜。用(1∶1 000)稀釋鼠抗iNOS以及Arg1，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用含0.05% Tween-20的緩沖液洗膜6次，去除殘留的一抗。按照同樣的方法孵育二抗(1∶5 000)，37 ℃孵育1～2 h，TBST洗膜6次，濾紙吸干，滴加顯影液，拍照，用條帶密度定量蛋白表達(dá)量。

1.6 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中腺苷的含量

ZLW處理24 h后，吸取上清再加樣，加入酶標(biāo)試劑37 ℃條件下溫育60 min，洗滌后顯色，加入終止液，在450 nm波長(zhǎng)下依序測(cè)量各孔的吸光度。

1.7 對(duì)硝基苯磷酸二鈉法檢測(cè)堿性磷酸酶酶活

取0.1 mL 20 mol/L的對(duì)硝基苯磷酸二鈉，加入1.8 mL 0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3(pH 9.7)緩沖液，混勻后于37 ℃下預(yù)熱 5～10 min，再加入100 μL SmAP液，37 ℃反應(yīng)10 min后立即加入1 mL 0.5 mol/L的NaOH停止酶促反應(yīng)，于405 nm處測(cè)吸收值，按公式計(jì)算酶活(U/mL)：酶活= OD405nm/(18.8×103×反應(yīng)時(shí)間)×103×測(cè)定液體積/酶液體積×稀釋倍數(shù)。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶和精氨酸酶1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平

利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，iNOS上游引物；GCAGAGATTGAGGCCTTGTG，下游引物：GGGTTGTTCTGAACTTCCAGTC。Arg1上游引物：A GACAGCAGGGAGGTGAAGAG，下游引物:CGAAGCAAGCAAGGTTAAAGC。β-Actin上游引物：GTCGTACCACAGGCATTGTGATGG，下游引物：GCAATGCCTGGGTACATGGTGG。常規(guī)方法提取各小組的總RNA后，檢測(cè)其RNA的純度，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后根據(jù)PCR試劑盒說明書進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

1.9 硝酸還原酶法測(cè)定細(xì)胞上清中一氧化氮的含量

取各小組100 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照硝酸還原酶法試劑盒，進(jìn)行孵育，以Bio-Rad 450酶標(biāo)儀550 nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸收值。

1.10 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志，鑒別M2型巨噬細(xì)胞

常規(guī)細(xì)胞爬片后，TBS緩沖液清洗3遍，加入4%多聚甲醛液置于4 ℃冰箱固定30 min，每孔加入200 μL含0.1%Triton的PBS，常溫透膜10 min。TBS緩沖液清洗10 min，用含10%FBS的培養(yǎng)基37 ℃封閉1h，巨噬細(xì)胞及M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記分子CD68、CD206抗體37 ℃孵育2 h，進(jìn)行熒光二抗37 ℃1h孵育，洗滌，熒光顯微鏡鏡檢。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 成功分離日本血吸蟲堿性磷酸酶

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，常規(guī)方法提取堿性磷酸酶后，BCA法檢測(cè)其蛋白濃度為600 mg/L，對(duì)硝基苯磷酸二鈉法檢測(cè)SmAP酶活，于405 nm處測(cè)吸收值，其酶活為1.2 U/mL。

2.2 各刺激因子最佳濃度

ELISA結(jié)果顯示，單磷酸腺苷干預(yù)正常的小鼠巨噬細(xì)胞24 h后，iNOS及Arg1的OD值在2.5 mmol/L濃度時(shí)出現(xiàn)了峰值，其最佳濃度為2.5 mmol/L(圖1)。同法測(cè)得堿性磷酸酶最佳濃度為1.1 mmol/L；多肽最佳濃度為0.6 mmol/L。三者確定了最佳濃度后，A2a受體激動(dòng)劑干預(yù)24 h，其最佳濃度為8 μmol/L，A2a受體抑制劑最佳濃度為4 μmol/L， A2b受體激動(dòng)劑最佳濃度為8 μmol/L，A2b受體抑制劑最佳濃度為8 μmol/L(圖1)。

圖1 ELISA測(cè)定各刺激因子最佳濃度

2.3 多肽干預(yù)后對(duì)細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶和精氨酸酶1的蛋白表達(dá)水平的影響

根據(jù)最佳濃度，添加堿性磷酸酶+單磷酸腺苷+多肽干預(yù)24 h后，Western blot結(jié)果示：與對(duì)照組相比，堿性磷酸酶+單磷酸腺苷+多肽組iNOS蛋白表達(dá)水平增加，Arg1的蛋白表達(dá)水平下降(圖2)。

2.4 多肽干預(yù)后對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中腺苷的影響

ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，堿性磷酸酶+單磷酸腺苷+多肽組腺苷濃度明顯下降(P<0.01,圖3)。

圖2 Western blot檢測(cè)iNOS和Arg1的蛋白表達(dá)水平

圖3 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中腺苷的含量(n=3)與對(duì)照組比較，*P<0.01

2.5 多肽干預(yù)后對(duì)堿性磷酸酶酶活的影響

與對(duì)照組相比，堿性磷酸酶+單磷酸腺苷+多肽組堿性磷酸酶的活性明顯降低(P<0.01，圖4)。

圖4 對(duì)硝基苯磷酸二鈉法檢測(cè)SmAP酶活(n=3)與對(duì)照組比較，*P<0.01

2.6 多肽干預(yù)后對(duì)細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶和精氨酸酶1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，堿性磷酸酶+單磷酸腺苷+多肽+A2a受體激動(dòng)劑(CGS21680)小組的iNOS的mRNA相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)(P<0.01)，堿性磷酸酶+單磷酸腺苷+多肽+A2b受體激動(dòng)劑(Bay60-6583)小組的Arg1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著上升(P<0.05，圖5)。

2.7 多肽干預(yù)后對(duì)細(xì)胞上清中一氧化氮的影響

結(jié)果顯示，與空白對(duì)照以及其他抑制劑、激動(dòng)劑小組相比，堿性磷酸酶+單磷酸腺苷+多肽組NO含量顯著上升(P<0.01，圖6)。

2.8 多肽干預(yù)后對(duì)M2型巨噬細(xì)胞的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量有所下降(圖7)。

圖5 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)iNOS和Arg1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(n=3)與對(duì)照組比較，*P<0.05A:各組iNOS的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(與對(duì)照組相比，P<0.01); B:各組Arg1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(與對(duì)照組相比，P<0.05)

圖6 硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞上清中NO的含量(n=3)與空白對(duì)照以及其他抑制劑、激動(dòng)劑小組相比,*P<0.01

3 討 論

在日本血吸蟲所導(dǎo)致的肝纖維化研究中發(fā)現(xiàn)，由經(jīng)典途徑激活的巨噬細(xì)胞(classicallyactivated macrophages，CAMφ，即M1型巨噬細(xì)胞)，提高關(guān)鍵酶一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表達(dá)，改善肝纖維化[7-8]；經(jīng)替代途徑激活的巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophages，AAMφ，即M2 型巨噬細(xì)胞)產(chǎn)生的關(guān)鍵酶精氨酸酶 1(arginase1，Arg1)，為肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSCs)的增殖提供更多的多胺[9]，從而促進(jìn)肝纖維化。為明確ZLW抑制日本血吸蟲宿主巨噬細(xì)胞M2極化的分子機(jī)制，在小鼠巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)中，單獨(dú)加入ZLW后，兩個(gè)關(guān)鍵酶iNOS及Arg1的表達(dá)沒有改變，可見ZLW不能直接干預(yù)宿主巨噬細(xì)胞的極化。

圖7 免疫熒光鑒別M2型巨噬細(xì)胞

前人的研究已經(jīng)證明，腺苷對(duì)巨噬細(xì)胞的抗炎作用與促炎細(xì)胞因子、趨化因子和一氧化氮釋放的抑制以及IL-10產(chǎn)生的增加有關(guān)，這些作用由A2a和A2b腺苷受體介導(dǎo)，巨噬細(xì)胞膜上的腺苷受體A2aR可抑制M1型極化，A2bR可促進(jìn)M2型極化[10]。在不同的組織研究中發(fā)現(xiàn)[11-12]，A2aR在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)有助于小鼠肺纖維化的進(jìn)展，與真皮成纖維細(xì)胞結(jié)合則促進(jìn)皮膚纖維化的形成；A2bR也在不同細(xì)胞類型上鑒定出各種促纖維化活性，具有調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞促纖維化活性的能力。腺苷的前體為單磷酸腺苷(AMP)，而日本血吸蟲堿性磷酸酶(Schistosome Membrane Alkaline Phosphatase，SmAP)可以激活宿主巨噬細(xì)胞膜表面腺苷前體單磷酸腺苷(AMP)[13-14]；前期本課題小組實(shí)驗(yàn)也證明了ZLW作用后，SmAP活性下降[4]。為此，在小鼠巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)中，單獨(dú)加入AMP或SmAP，經(jīng)ZLW的作用也無明顯的變化，由此可知ZLW不能直接干預(yù)巨噬細(xì)胞的極化，也不能通過AMP干預(yù)巨噬細(xì)胞的極化；然而當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)加入AMP和SmAP，經(jīng)ZLW作用后，Arg1的表達(dá)下調(diào)，iNOS增加(圖2，圖5)，細(xì)胞培養(yǎng)上清中腺苷的合成減少(圖3)，堿性磷酸酶酶活下降(圖4)，NO含量上升(圖6)，免疫熒光結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量有所下降(圖7)。由此可見ZLW必須通過調(diào)控SmAP的活性，間接抑制宿主巨噬細(xì)胞的M2極化狀態(tài)。

由于A2a受體激動(dòng)劑能減輕炎癥的損傷，A2b受體拮抗劑可以抑制炎癥細(xì)胞的活性，其激動(dòng)劑在腺苷以及衍生物的抗炎機(jī)制中起著非常重要的作用[15-17]。因此為了進(jìn)一步驗(yàn)證A2aR、A2bR對(duì)巨噬細(xì)胞極化、炎癥因子產(chǎn)生及纖維化的影響，本實(shí)驗(yàn)在處理組中分別添加了兩種受體的激動(dòng)劑以及抑制劑(圖5)。結(jié)果顯示A2bR促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化，A2aR抑制巨噬細(xì)胞M1極化，抑制了NO的產(chǎn)生，證明ZLW可以通過激活巨噬細(xì)胞膜的腺苷受體，干預(yù)巨噬細(xì)胞的極化，從而影響纖維化的發(fā)生發(fā)展。