王升啟榮 振王素華姜 海

布魯氏菌病是一種世界范圍內(nèi)常見的人獸共患疾病，全世界每年有超過50萬例新發(fā)病例診斷為布魯氏菌病[1]。該病給養(yǎng)殖生產(chǎn)者和國家造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，作為生物恐怖病原被一些西方國家用作生物戰(zhàn)劑[2]，危害國家安全和人民健康。近年來，布魯氏菌病的疫情出現(xiàn)回升趨勢，并且引發(fā)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。傳統(tǒng)鑒定布魯氏菌方法主要以試管凝集試驗(yàn)(SAT)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)為主。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些新的方法技術(shù)被用到布魯氏菌的檢測中來[3-4]。而以膠體金為標(biāo)記物的免疫層析方法(GICA)，因操作簡單、結(jié)果易判讀、血清用量少、成本低、無需專業(yè)技術(shù)人員以及專業(yè)設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于布魯氏菌病的現(xiàn)場檢測。量子點(diǎn)(Quantum dots，QDs)作為一種新型的熒光標(biāo)記材料，因其具有較好的熒光特性，廣泛應(yīng)用于發(fā)光生物探針領(lǐng)域量，以用來提高檢測靈敏度[5-7]。相較于膠體金免疫層析法，量子點(diǎn)免疫層析技術(shù)的應(yīng)用前景也非常廣闊。因此，本研究將量子點(diǎn)代替膠體金，開發(fā)一種量子點(diǎn)免疫層析技術(shù)，以檢測血清中的布魯氏菌抗體。

1 材料和方法

1.1材料及儀器 硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrane，NC膜,型號(hào)：HF13502S25)；玻璃纖維素膜(型號(hào)：Ahlstrom8964)；血清樣品墊(型號(hào)：XQ-Y2)；吸水紙(型號(hào)：H5072)；PVC底板(型號(hào)：DB-6)，以上均購自上海杰一生物技術(shù)有限公司；劃膜儀(型號(hào)：XY1000，Bio-Dot公司)；微電腦自動(dòng)斬切機(jī)(型號(hào)：ZQ2000，上海金標(biāo)生物科技公司)；高功率數(shù)控超聲清洗儀(型號(hào)：KQ-800KDE)；冷凍干燥機(jī)(型號(hào)：LGJ-10B，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠)；全系列德國eppendorf離心機(jī)(型號(hào)：C5424)；數(shù)控裁條機(jī)(型號(hào)：CTS300，上海金標(biāo)生物科技有限公司)。

1.2試劑 牛血清白蛋白(BSA)，含吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)，2-嗎啉乙磺酸溶液(Mercaptosuccinicacid，MES)；N-羥基琥珀酰亞胺 (N-hydroxysuccinimide，NHS)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，Sigma公司)；量子點(diǎn)(QDs，表面活性基團(tuán)為羧基，購自于NanoGen公司)；布魯氏菌全菌蛋白(由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供)；蛋白A(staphylococcal protein A，SPA，Sigma公司)，其他試劑均為分析純。試驗(yàn)中所用水(18.2MΩ)由Milli-Q純水系統(tǒng)提供。

1.3樣本來源 布魯氏菌病病人陽性血清、布魯氏病國家標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、正常人陰性血清由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供，含炭疽、霍亂抗原血清由軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所分子診斷實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 方 法

1.4.1量子點(diǎn)的偶聯(lián)及包被 取25 μL QDs，加5 μL 0.1 mol/L pH6.0 MES和20 μL去離子水洗滌；加入一定量的交聯(lián)劑NHS 、EDC 37 ℃下活化30 min；反應(yīng)結(jié)束后離心棄上清液，加入10 mol/L MES的溶液重懸至量子點(diǎn)原始體積，加入一定量的布魯氏菌全菌蛋白溶液充分反應(yīng)，使用BSA進(jìn)行封閉，待封閉完成離心后棄去上清液，根據(jù)需要稀釋至合適濃度均勻噴涂在釋放墊上，冷凍干燥3～4 h。

1.4.2硝酸纖維素膜的包被 將SPA和布魯氏菌全菌蛋白稀釋至所需濃度，分別作為C線(質(zhì)控線)和T線(檢測線)，將膜置于相對(duì)濕度20%，溫度37 ℃條件下干燥2.5～3 h。

1.4.3試紙條的組裝 將樣品墊、釋放墊、層析膜、吸收墊相互重疊1～1.5 mm粘貼在PVC底板上。其中樣品墊和結(jié)合墊為玻璃纖維素膜，層析膜采用硝酸纖維素膜，吸水紙采用吸水濾紙，試紙條結(jié)構(gòu)見圖1。將組裝好的試紙條切割成長6.5 cm、寬3.5 mm，加入干燥劑后室溫密封保存。

1.4.4檢測原理及結(jié)果判定 本研究采用雙抗原夾心法，檢測過程如下：將待測樣品滴加到樣品墊上，當(dāng)樣品中存在布魯氏菌抗體時(shí)，會(huì)和釋放墊上QDs標(biāo)記物結(jié)合，形成QDs-Ag-抗體免疫復(fù)合物，流經(jīng)檢測線時(shí)，該免疫復(fù)合物和固定在檢測線上的抗原結(jié)合，發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，此時(shí)一部分量子點(diǎn)固定在檢測線上，形成T線。未與抗原發(fā)生反應(yīng)的免疫復(fù)合物繼續(xù)向前遷移，流經(jīng)質(zhì)控線時(shí)被固定的二抗(SPA)捕獲，發(fā)生免疫反應(yīng)，形成C線。多余的QDs標(biāo)記物則會(huì)遷移，最終停留在吸收墊處。

以布魯氏菌病陽性血清為樣品,滴加70 μL到試紙條樣品墊，反應(yīng)10 min后在紫外燈照射下查看結(jié)果。若C線出現(xiàn)紅色條帶，T線無條帶，判定為陰性；若C線和T線均出現(xiàn)紅色條帶，判定為陽性；若C線無條帶，不論T線有無條帶均視試紙條無效。

圖1 量子點(diǎn)免疫層析試紙條模型圖Fig.1 Mmodel diagram of a quantum dot immunochromatographic strip

1.5試紙條的初步性能評(píng)價(jià)試驗(yàn) 將陽性血清(1∶3 200)稀釋成不同濃度滴加到樣品墊上，以PBST稀釋的BSA和正常人陰性血清作對(duì)照進(jìn)行檢測，出現(xiàn)熒光條帶的血清最高稀釋度作為試紙條的靈敏度。同時(shí)檢測牛血清白蛋白、炭疽陽性血清、霍亂陽性血清、正常人陰性血清、布魯氏菌病陽性血清，判斷該試紙條有無非特異性。將102份布魯氏菌病陽性血清和47份健康人陰性血清分別使用試紙條和試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行檢測，計(jì)算兩種方法的符合率。

2 結(jié) 果

2.1試紙條的優(yōu)化 本研究從QDs用量、抗原標(biāo)記使用量、抗原包被量、封閉時(shí)間、封閉劑用量等方面進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)熒光亮度確定T線、C線的包被濃度分別為2 mg/mL、1 mg/mL，固定噴涂T線、C線的包被量分別設(shè)置為0.6 μL/cm、1 μL/cm。當(dāng)QDs標(biāo)記的抗原使用量為15 μL時(shí)，T線熒光最強(qiáng)，而在使用量分別為10 μL、20 μL時(shí)，熒光強(qiáng)度出現(xiàn)下降趨勢，分析可能是抗原過少未能與QDs完全偶聯(lián)，抗原過多抑制QDs偶聯(lián)效率。當(dāng)封閉劑加入量為25 μL、封閉時(shí)間為3 h時(shí)，試紙條的熒光效果最好。最后對(duì)QDs用量進(jìn)行了優(yōu)化，使用25 μLQDs可使其熒光最強(qiáng)。后續(xù)試紙條性能評(píng)價(jià)試驗(yàn)均采用上述優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行檢測。

2.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 該試紙條重復(fù)性較好，紫外燈照射下陽性、陰性血清無特異性出現(xiàn)，并且陽性血清T線亮度沒有出現(xiàn)下降的趨勢。

2.3特異性試驗(yàn)結(jié)果 該試紙條檢測牛血清白蛋白、炭疽陽性血清、霍亂陽性血清、正常人陰性血清T線位置均無條帶；檢測布魯氏菌病陽性血清T線位置出現(xiàn)條帶，證明該試紙條無特異性出現(xiàn)。

2.4靈敏度試驗(yàn)結(jié)果 使用試紙條分別檢測原液、稀釋為2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍8種不同濃度陽性血清，在紫外燈照射下不同稀釋倍數(shù)陽性血清均出現(xiàn)T線(見圖2)。

(從左到右依次為原液、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍)圖2 試紙條靈敏度試驗(yàn)結(jié)果圖Fig.2 Test results of strip sensitivity

2.5試紙條性能初步評(píng)價(jià)結(jié)果 經(jīng)試管凝集試驗(yàn)及量子點(diǎn)免疫層析試紙條檢測，試紙條檢測敏感性為99.0%，特異度為95.8%，兩種方法符合率為98.0%,見表1。

表1 兩種不同方法檢測病例結(jié)果Tab.1 Cases tested with different methods

量子點(diǎn)標(biāo)記試紙條試管凝集試驗(yàn)+-合計(jì)+1002102-14647合計(jì)10148149

2.6試紙條穩(wěn)定性結(jié)果 用同一批次制備的試紙條分別在第5、10、15、20、25、30、35 d時(shí)檢測布魯氏菌病陽性血清，用干式免疫熒光分析儀對(duì)試紙條讀取T值，重復(fù)3次檢測并取平均值(見圖3)，其變異系數(shù)為4.1 %，表明量子點(diǎn)免疫層析試紙條檢測布魯氏菌病抗體重復(fù)性好，一個(gè)月的保存期內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖3 量子點(diǎn)試紙條穩(wěn)定性試驗(yàn)Fig.3 Stability test of paper strip with quantum dots

3 討 論

近年來，量子點(diǎn)作為一種優(yōu)異的熒光標(biāo)記物引起人們的重視，因其具有較寬的吸收峰，較高的熒光強(qiáng)度，穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，與傳統(tǒng)發(fā)光材料相比具有更優(yōu)越的性能，是一種極具潛力的熒光探針制備物，在生物領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)免疫方面得到飛速的發(fā)展，已廣泛應(yīng)用于副溶血弧菌[8]、C反應(yīng)蛋白[9]的檢測和非洲豬瘟[10]、中東呼吸綜合征[11]等傳染病的快速診斷研究。目前在生物領(lǐng)域使用的免疫層析試紙條多以膠體金為標(biāo)記物，其普遍存在靈敏度低、易現(xiàn)假陽性等問題。本研究所制備的量子點(diǎn)免疫層析試紙條是基于免疫層析技術(shù)和抗原-抗體特異性反應(yīng)建立的快速檢測布魯氏菌病抗體的方法，其過程是將金黃色葡萄球菌A蛋白與布魯氏菌全菌蛋白固定于硝酸纖維素膜，量子點(diǎn)與全菌蛋白偶聯(lián)物稀釋后與釋放墊冷凍干燥，構(gòu)建免疫層析系統(tǒng)，組裝量子點(diǎn)免疫層析試紙條檢測布魯氏菌抗體。該法不僅結(jié)合了免疫反應(yīng)與層析技術(shù)準(zhǔn)確快速的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)選擇了能與布魯氏菌抗體特異性結(jié)合的布魯氏菌抗原，相比于膠體金試紙，由于量子點(diǎn)基于熒光顯色，因而其抗干擾性更強(qiáng)，檢測限更低。同時(shí)該試紙條應(yīng)用范圍廣，可針對(duì)感染布魯氏菌的人或動(dòng)物進(jìn)行檢測，相較于市場現(xiàn)有的僅用來檢測動(dòng)物布魯氏菌病的膠體金試紙條，其更加具有應(yīng)用價(jià)值。

本研究對(duì)試紙條制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，設(shè)計(jì)制成了量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條，用于檢測血清中布魯氏菌抗體，在15 min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)布病的檢測。血清用量少，當(dāng)使用10 μL人或動(dòng)物血清，依舊可以對(duì)其進(jìn)行檢測。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，量子點(diǎn)免疫層析試紙條是一種特異性強(qiáng)的檢測方法，分別滴加正常人陰性血清、胎牛血清、炭疽陽性血清、霍亂陽性血清均無非特異。朱明東等[12]使用膠體金免疫層析法檢測人血清的研究中，當(dāng)血清用量為10 μL時(shí)，敏感性和特異性分別為93.6%和94.9%；另一篇關(guān)于膠體金法檢測布魯氏菌的研究中[13]，采集某市地方病防治中心布病門診的就診者血清，以布魯氏菌分離培養(yǎng)作為確診布病的“金標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，該課題組自制的膠體金診斷試劑盒對(duì)確診病人診斷的靈敏度為94.12%，特異度為79.41%，該試劑盒與布病診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”比較Kappa值為0.724，符合率為86.76%。Wang[14]等以SAT法作為金標(biāo)準(zhǔn)，GICA法靈敏度和特異度分別為94.1%和81.0%?？偡下蔬_(dá)到88.5%。在本研究中，以試管凝集試驗(yàn)作為布病確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”，使用自制的量子點(diǎn)免疫層析試紙條對(duì)149例臨床血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示其敏感度為99.0%，特異度為88.9%，兩種方法符合率為98.0%。從本次研究檢測布魯氏菌病中，敏感性、靈敏度等均較高，但是由于收集病例較少，因此后期還需要加大樣本量繼續(xù)驗(yàn)證靈敏度。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，布魯氏菌的現(xiàn)場快速檢測技術(shù)已經(jīng)有了很大的進(jìn)展。本試驗(yàn)利用量子點(diǎn)標(biāo)記的免疫層析試紙條檢測布魯氏菌病，不論是在試驗(yàn)儀器的使用，檢測時(shí)間的時(shí)長，檢測技術(shù)的應(yīng)用等方面，以及對(duì)檢測布魯氏菌病敏感性與特異性上都具有顯著的優(yōu)勢。該方法與試管凝集試驗(yàn)相比，仍然具有操作便捷、省時(shí)省力、靈敏度髙、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本研究方法制備的量子點(diǎn)免疫層析試紙條將布魯氏菌全菌蛋白作為標(biāo)記抗原，其在目標(biāo)血清檢測方面應(yīng)用更加廣泛，具有便攜、高靈敏度、檢測時(shí)短、特異等優(yōu)點(diǎn)，更適合于布魯氏菌病診斷、流行病學(xué)調(diào)查及現(xiàn)場應(yīng)用，同時(shí)在牧區(qū)布魯氏菌病檢測、疫情控制等方面提供一種新的檢測方法。

利益沖突：無

引用本文格式：李廣強(qiáng),王升啟,榮振,等.量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析技術(shù)檢測布魯氏菌病的方法研究[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2019,35(5):389-392，398.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.049