金蓉，謝文華，陳杰標(biāo)，王念晨，項白雪，王岳，曹錦萍*

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝植物生長發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控重點開放實驗室，杭州 310058；2.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗站，杭州 310058）

鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）是我國傳統(tǒng)的藥食同源植物，其莖干常用作保健食品。鐵皮石斛莖干富含水溶性多糖，可占其干質(zhì)量的19.2%～58.0%[1-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，鐵皮石斛水溶性多糖具有抗氧化損傷[4]、抗癌[5]、抗疲勞[6]和免疫調(diào)節(jié)[7-8]等功效。因此，水溶性多糖含量是鐵皮石斛品質(zhì)評估的重要指標(biāo)之一[9]。

提取鐵皮石斛水溶性多糖最常用的方法為熱水回流提取，并結(jié)合乙醇沉淀[1，9]。此外，還有酶解法[10]、超聲輔助提取法[11]和微波輔助提取法[12-13]，可在一定程度上改善提取效率。

超聲輔助提取是目前廣泛使用的物質(zhì)提取方法，它通過機械、熱學(xué)及空化等作用加速目標(biāo)成分進入溶劑，操作簡便。在牛肝菌（Boletus edulis）、萵苣（Lactuca sativa）、菱角（Trapa quadrispinosa）、蜆（Corbicula fluminea）等多種動植物多糖提取研究中均發(fā)現(xiàn)，利用超聲輔助提取可提高提取效率[14-17]。前人就多糖超聲輔助提取方法優(yōu)化已有大量報道，發(fā)現(xiàn)影響提取得率的因素主要有超聲強度、超聲時間和提取溫度[14，16-17]。在一定范圍內(nèi)，多糖得率隨著超聲強度、時間和提取溫度的升高而升高[16，18-19]，但在高強度的超聲條件下，多糖的結(jié)構(gòu)會發(fā)生一定程度的改變。已有的研究表明，超聲輔助提取會使多糖溶液黏度和顆粒大小下降[20-21]，并改變多糖分子的單糖組成[22]。此外，超聲處理會產(chǎn)生降解的多糖片段[23]，并且超聲處理后多糖的生物活性往往有所提高[22，24]。

目前，在鐵皮石斛品質(zhì)評估中對水溶性多糖含量的定量分析仍用傳統(tǒng)的熱水回流方法[9]，但當(dāng)樣品較多時，需分批進行提取，耗時費力。盡管超聲輔助提取在其他植物多糖提取中已廣泛應(yīng)用，但在鐵皮石斛水溶性多糖提取方面僅見超聲水浴輔助提取方法的優(yōu)化研究[11]，而對于超聲熱水輔助提取工藝及其對鐵皮石斛水溶性多糖結(jié)構(gòu)的影響尚未有報道。為此，本研究旨在比較常溫和熱水提取體系中超聲輔助提取對鐵皮石斛水溶性多糖得率和結(jié)構(gòu)的影響，為超聲輔助提取方法在鐵皮石斛水溶性多糖提取中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

13個鐵皮石斛品種的二年生植株采自浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗站種植基地，分別為‘浙農(nóng)3號’、‘仙源種’、‘牧歌 2 號’、‘牧歌 2 號’高產(chǎn)型品系、‘牧歌 1號’、‘圣蘭 8 號’、‘原生種’、‘浙南種’、‘牧歌 1 號’耐寒型品系、‘牧歌3號’、‘天柱峰種’、‘霍山種’和‘浙中種’。將植株莖干和葉片分別切成小塊，經(jīng)液氮速凍后置于－80℃冰箱中保存，待用。

3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one,PMP）、甘露醇、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、巖藻糖、木糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸為色譜純試劑，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。色譜純乙腈和三氟乙酸（trifluoroacetic acid,TFA）購自美國Sigma-Aldrich公司。其他分析純試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 多糖提取條件比較

將鐵皮石斛莖干在液氮中研磨成粉末，稱取約3 g，按照料液質(zhì)量體積比為3∶200的比例加入室溫（約14℃）或煮沸（約100℃）的蒸餾水。按照表1所示的提取參數(shù)進行提取，并用溫度計測量水溫。超聲輔助提取儀為JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機（浙江寧波新芝生物科技股份有限公司），功率為20 kHz。提取液用4層紗布進行真空抽濾，濾渣再用50 mL蒸餾水沖洗和過濾。合并濾液（約250 mL），于45℃條件下減壓蒸發(fā)濃縮至100 mL，向溶液中緩緩加入4倍體積經(jīng)4℃預(yù)冷的95%乙醇，充分混勻后于4℃條件下靜置過夜，沉淀多糖。離心收集沉淀，并依次用無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌沉淀各2次。將沉淀物于60℃條件下烘干，得到富含多糖的水溶性組分（water-soluble fraction,WSF），稱量后于4℃條件下儲存，待用。每個提取方法重復(fù)3次。

1.3 多糖含量和純度檢測

多糖含量測定參照前人的苯酚-硫酸法[25]并稍作改進。將WSF溶于蒸餾水，配成0.1 mg/mL溶液，取0.06 mL多糖溶液與0.18 mL苯酚-硫酸測定液（5%苯酚溶液與98%濃硫酸按體積比1∶5混勻而成）混勻，沸水浴反應(yīng)30 min后用BioTek Synergy H1酶標(biāo)儀在490 nm波長下進行讀數(shù)。用葡萄糖溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得結(jié)果以g/kg（按鮮質(zhì)量計）表示。

多糖中所含的酚類雜質(zhì)含量測定按Folin-Ciocalteu法[26]并稍作改進。將WSF溶于蒸餾水，配成5 mg/mL溶液，取0.1 mL該溶液，加入0.8 mL蒸餾水和0.1 mL 0.5 mol/L Folin-Ciocalteau試劑，混勻后加入0.2 mL 75 g/L Na2CO3溶液，混勻，置于30℃條件下反應(yīng)2 h。反應(yīng)產(chǎn)物用BioTek Synergy H1酶標(biāo)儀在760 nm波長下進行讀數(shù)。用沒食子酸溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得結(jié)果以mg/g（按鮮質(zhì)量計）表示。

多糖中所含的蛋白質(zhì)雜質(zhì)按照Bradford法蛋白質(zhì)定量試劑盒（Bio-Rad公司，美國）說明書進行定量。

1.4 多糖相對分子質(zhì)量測定

采用凝膠滲透色譜法（gel permeation chromatography,GPC）對多糖樣品的相對分子質(zhì)量進行測定。將樣品用水溶解后配成5 mg/mL溶液，上樣量為50 μL。具體色譜條件為：Waters 1525液相色譜系統(tǒng)；Waters 2414示差折光檢測器；TSKGEL G4000 PWXL凝膠色譜柱（Tosoh公司，日本）；流動相為0.2 mol/L NaCl，流速為0.5 mL/min，柱溫40℃，檢測器溫度40℃。采用摩爾質(zhì)量為6.7×105、4.1×105、2.7×105、1.5×105、0.8×105、0.5×105、0.25×105和0.12×105g/mol的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（GE公司，美國）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用于多糖相對分子質(zhì)量計算。

1.5 多糖的紅外光譜分析

將1 mg WSF與100 mg KBr粉末混勻后壓成厚度為1 mm的薄片，在4 000～400 cm－1范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描，分辨率為4 cm－1，掃描次數(shù)為32。

1.6 多糖的剛果紅結(jié)合試驗

多糖的剛果紅結(jié)合能力測試參照NIE等的方法[15]并稍作修改。將WSF溶于蒸餾水，配成1 mg/mL溶液，取1 mL該溶液與等體積的80 μmol/L剛果紅溶液混合。將1 mol/L NaOH逐漸加入混合溶液中，使混合液中NaOH終濃度分別達(dá)到0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mol/L，室溫放置5 min后用DU-8000分光光度計（Beckman公司，美國）進行全波長掃描，測定混合液的最大吸收波長。對照用蒸餾水代替多糖溶液進行反應(yīng)和測定。

1.7 鐵皮石斛水溶性多糖的單糖組成分析

采用柱前衍生高效液相色譜法分析單糖組成[27]。稱取1 mg WSF樣品，用1 mL 2 mol/L TFA溶液溶解，加入安瓿瓶中，于密閉、120℃條件下水解2h。水解產(chǎn)物于30℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸干后，用甲醇溶解、蒸干，重復(fù)3次，以去除TFA殘留。將蒸干后的樣品溶于100 μL蒸餾水中，制成10 mg/mL樣品溶液，用于衍生化分析。每個樣品設(shè)3個重復(fù)。

衍生化分析步驟如下：取樣品或標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μL，加入120 μL 0.5 mol/L PMP 溶液和100 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，于70℃水浴反應(yīng)1 h，冷卻至室溫后加入100 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和，然后加入1 mL二氯甲烷萃取，以1×104r/min離心5 min，取上層水相，再用二氯甲烷萃取2次，即得衍生產(chǎn)物，用0.22 μm濾膜過濾后用于高效液相色譜（high performance liquid chromatography,HPLC）分析。HPLC分析條件為：Water 2695-2996液相色譜系統(tǒng)（Waters公司，美國）；Sunfire C18色譜柱（Waters公司，美國）；柱溫25℃；流動相為NaOH-KH2PO4緩沖液（pH 6.7）（A相）和乙腈（B相）；洗脫程序為0～30 min，18%B→30～60 min，18%～25%B→60～65 min，25%～18%B；上樣量10 μL；流速1 mL/min；檢測波長245 nm。

1.8 品種間多糖含量比較

將13個鐵皮石斛品種的莖干和葉片分別在液氮中研磨成粉，采用超聲輔助熱水提取法（超聲頻率20 kHz，功率500 W，95～100℃熱水）提取3 min，提取過程參照1.2中描述的方法，對所得到的WSF稱量，并計算多糖含量。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并采用鄧肯顯著性檢驗方法對組間數(shù)據(jù)進行多重比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取參數(shù)對鐵皮石斛水溶性多糖得率的影響

以鐵皮石斛品種‘圣蘭8號’為例，不同提取參數(shù)對其多糖WSF得率的影響見表1?？梢钥闯?，在不同提取參數(shù)下，‘圣蘭8號’莖干多糖WSF提取得率為67.40～121.90 g/kg（按鮮質(zhì)量計）。常溫水（14℃）在不同功率超聲輔助提取過程中溫度會略有升高（均在20℃左右），而熱水（100℃）則有所降低，為95～100℃。在常溫提取體系中，超聲功率低于100 W時，WSF得率隨著功率升高而增加，而超聲功率升至500 W時，WSF得率反而下降。該結(jié)果與前人的報道[18-19]類似，表明超聲輔助提取多糖時其強度有一個最適范圍。然而，在超聲和熱水結(jié)合的提取體系中，超聲功率100 W與300 W之間差異并不顯著，且均顯著低于熱水回流提?。▽φ眨?，原因可能是超聲輔助提取時間較短（3 min），而熱水回流時間較長（2 h）。當(dāng)熱水提取體系中超聲功率達(dá)到500 W時，提取效率顯著升高，并接近于熱水回流提取2 h的得率。在相同超聲強度下，熱水提取體系的得率顯著高于常溫提取體系。因此，超聲輔助熱水提取可以提高鐵皮石斛多糖得率，并大大縮短提取時間。

表1 在不同提取參數(shù)下‘圣蘭8號’鐵皮石斛水溶性多糖的得率和純度Table 1 Yield and purity of water soluble polysaccharides from Dendrobium officinale‘Shenglan No.8’under different extract parameters

植物中提取的多糖樣品常常含有酚類物質(zhì)和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。如表1所示，本研究得到的WSF多糖含量為86.48%～93.58%，酚類物質(zhì)含量均≤0.011%，而蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量為1.29%～3.18%?？傮w而言，熱水提取得到的WSF中蛋白質(zhì)含量較冷水提取得到的WSF中的低，可能的原因是部分蛋白質(zhì)在熱水提取時發(fā)生變性沉淀，在過濾時被去除。在常溫和熱水提取系統(tǒng)中，WSF中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量均表現(xiàn)為：前期隨著超聲強度的升高而升高，但當(dāng)超聲功率達(dá)到500 W時，蛋白質(zhì)雜質(zhì)含量下降。

總之，從提取用時、得率和純度等方面綜合考慮，在超聲強度為500 W、水溫為95～100℃、提取時間為3 min時鐵皮石斛水溶性多糖的提取效率最高。

2.2 不同提取參數(shù)對鐵皮石斛水溶性多糖摩爾質(zhì)量的影響

GPC分析結(jié)果表明，常溫攪拌提取得到的鐵皮石斛水溶性多糖GPC圖譜為分布較為均一的單個寬峰（圖1），重均相對摩爾質(zhì)量（Mw）為2.95×105g/mol，多分散度為4.74（表2）。超聲輔助提取后，在小分子質(zhì)量區(qū)域出現(xiàn)了明顯的峰，其中500 W超聲輔助提取最為明顯（圖1）。此外，超聲輔助提取使鐵皮石斛水溶性多糖的摩爾質(zhì)量分布范圍更寬，表現(xiàn)為多分散度（polydispersity,PDI）值明顯升高，其中以500 W超聲輔助提取的PDI值最高（表2）。這些結(jié)果表明，高強度超聲輔助提取會造成鐵皮石斛水溶性多糖鏈結(jié)構(gòu)的破壞。

前人在植物多糖提取研究時發(fā)現(xiàn)，超聲處理會降低多糖分子質(zhì)量[21，24]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)超聲輔助提取后鐵皮石斛多糖GPC圖譜從均一分布的單峰變?yōu)槎喾?，并在低分子質(zhì)量區(qū)域出峰（圖1），這一結(jié)果與前人研究結(jié)果相一致。前人研究還發(fā)現(xiàn)，超聲處理后多糖摩爾質(zhì)量分布更窄[21]，但本研究發(fā)現(xiàn)超聲輔助提取得到的鐵皮石斛多糖摩爾質(zhì)量分布更寬，表現(xiàn)為PDI值增加（表2），推測可能與不同植物多糖耐降解特性不同，以及在不同研究中超聲強度等具體提取參數(shù)有所差異相關(guān)。此外，由圖1可知，經(jīng)超聲處理，尤其是經(jīng)500 W處理的樣品在GPC分析時提早出峰，表明大分子質(zhì)量多糖的比例較高，推測超聲處理對大分子質(zhì)量多糖的提取可能具有促進作用。

圖1 不同提取參數(shù)下‘圣蘭8號’鐵皮石斛多糖的GPC圖譜Fig.1 GPC spectrum of water soluble polysaccharides from D.officinale‘Shenglan No.8’under different extract parameters

表2 不同提取參數(shù)下‘圣蘭8號’鐵皮石斛水溶性多糖摩爾質(zhì)量Table 2 Molecular size of water soluble polysaccharides from D.officinale‘Shenglan No.8’under different extract parameters

2.3 不同提取參數(shù)對鐵皮石斛水溶性多糖剛果紅結(jié)合能力的影響

剛果紅可與含三股螺旋鏈構(gòu)象的多糖發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，進而使絡(luò)合物的吸收發(fā)生紅移，且在一定的NaOH濃度范圍內(nèi)呈亞穩(wěn)性，呈現(xiàn)最大吸收波長的特征變化。本研究結(jié)果（圖2）表明：鐵皮石斛水溶性多糖能使剛果紅溶液最大吸收波長發(fā)生紅移，表明鐵皮石斛多糖具有一定的剛果紅結(jié)合能力，因此可能存在三股螺旋結(jié)構(gòu)，這與前人的報道[8，28]相一致；在0～0.5 mol/L NaOH溶液中，在各提取參數(shù)下得到的鐵皮石斛多糖與剛果紅的結(jié)合能力保持穩(wěn)定（最大吸收波長基本恒定），表明超聲輔助提取對多糖的剛果紅結(jié)合能力無明顯影響，說明本研究的超聲條件對三股螺旋結(jié)構(gòu)無顯著影響。

2.4 不同提取參數(shù)對鐵皮石斛水溶性多糖紅外光譜的影響

從鐵皮石斛多糖紅外圖譜（圖3）可以看出：在3 100～3 600 cm－1之間的寬峰是由O—H伸縮振動引起的；在2 920 cm－1和2 886 cm－1處為C—H伸縮振動峰；1377cm－1處為C—H變角振動峰[8，29]；1730 cm－1處的吸收峰屬于酯羰基C═O伸縮振動，表明分子中存在乙?；鶊F[8，29-30]；1 644 cm－1處為結(jié)合水的特征峰[30]；1 251 cm－1處的吸收峰是由O-乙酰基團的C—O伸縮振動引起的；1 031 cm－1屬于糖環(huán)的特征吸收峰[8]；此外，897 cm－1處的吸收峰表明多糖中存在β-糖苷鍵[7-8]。

圖2 不同提取參數(shù)下‘圣蘭8號’鐵皮石斛水溶性多糖的剛果紅結(jié)合能力Fig.2 Congo red binding capacity of water soluble polysaccharidesfromD.officinale‘ShenglanNo.8’under different extract parameters

在不同提取參數(shù)下得到的鐵皮石斛多糖的紅外圖譜相似（圖3），表明超聲強度對鐵皮石斛多糖的一級結(jié)構(gòu)沒有影響。這與前人對魔芋葡甘露聚糖[20]、桑黃多糖[21]的研究結(jié)果一致。

2.5 不同提取參數(shù)對鐵皮石斛水溶性多糖單糖組成的影響

從表3和圖4可以看出：鐵皮石斛‘圣蘭8號’水溶性多糖的主要單糖成分為甘露糖和葡萄糖，在不同提取參數(shù)下甘露糖和葡萄糖的摩爾百分比分別為75.58%～79.48%和15.76%～21.02%；此外，還檢出了4種中性單體（鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和木糖）及2種糖醛酸（葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸），但所占摩爾比例均不超過2%。前人研究也發(fā)現(xiàn)，甘露糖和葡萄糖是鐵皮石斛水溶性多糖的主要單糖成分[2，7-8，29]。LUO 等[30]檢測發(fā)現(xiàn) ，鐵皮石斛水溶性多糖除含有甘露糖和葡萄糖外，還含有阿拉伯糖和少量的半乳糖醛酸，4種單糖的摩爾比為6.2∶2.3∶2.1∶0.1；XING等[2]發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛多糖中含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖4種單糖組分。本研究發(fā)現(xiàn)，鼠李糖、木糖和葡萄糖醛酸也是鐵皮石斛多糖的單糖組分，這在以往文獻中均沒有報道。

圖3 不同提取參數(shù)下‘圣蘭8號’鐵皮石斛水溶性多糖的紅外圖譜Fig.3 Infrared spectrum of water soluble polysaccharides from D.officinale‘Shenglan No.8’under different extract parameters

如表3所示，在常溫和熱水提取體系中，超聲輔助提取對于鐵皮石斛多糖的單糖組成均無顯著影響，這與前人在桑黃多糖中的研究結(jié)果[21]一致。因此，短時間超聲輔助熱水提取法適用于制備用于單糖組成分析的鐵皮石斛多糖。

2.6 鐵皮石斛品種間水溶性多糖含量比較

前文的研究結(jié)果表明，500 W超聲輔助熱水提取鐵皮石斛多糖的效率最佳，得率與傳統(tǒng)的沸水回流提取相當(dāng)，因而，該方法適用于不同鐵皮石斛樣品間多糖含量的比較。本研究將該方法應(yīng)用于13個鐵皮石斛品種莖和葉片多糖含量的定量分析，結(jié)果（圖5）表明：13個品種鐵皮石斛二年生莖的多糖含量高于葉片，莖中為69.40～130.10 g/kg（按鮮質(zhì)量計），葉片中為15.30～34.10 g/kg（按鮮質(zhì)量計）。各品種間的多糖含量存在較大差異，并隨組織不同而有所不同，其中：莖中多糖含量最高的品種為‘浙農(nóng)3號’，最低的為‘浙中種’，前者為后者的1.87倍；葉片多糖含量最高的品種為‘浙南種’，最低的為‘天柱峰種’，前者為后者的2.23倍。

表3 不同提取參數(shù)下鐵皮石斛‘圣蘭8號’多糖的單糖組成Table 3 Monosaccharide composition of water soluble polysaccharides from D.officinale‘Shenglan No.8’under different extract parameters %

圖4 鐵皮石斛‘圣蘭8號’水溶性多糖中單糖組成的HPLC圖譜Fig.4 HPLC spectrum of monosaccharides from D.officinale‘Shenglan No.8’water soluble polysaccharides

前人研究結(jié)果表明，從廣東、浙江、云南和福建等產(chǎn)地采收的鐵皮石斛新鮮莖干中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.22%～5.59%，葉片中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.95%～1.90%[31]，而鐵皮石斛干樣中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均為58.3%[2]。本研究分析的13個鐵皮石斛品種的多糖含量普遍高于前人的報道[31]。鐵皮石斛水溶性多糖含量因品種、苗齡、產(chǎn)地和栽培管理措施等因素而異[1]，這可能是造成不同研究之間其含量差異的原因。

圖5 不同品種二年生鐵皮石斛莖（A）和葉片（B）的多糖含量Fig.5 Polysaccharide contents of stems(A)and leaves(B)from different D.officinale cultivars

3 結(jié)論

超聲輔助顯著提高了鐵皮石斛多糖的提取效率，篩選出的最佳參數(shù)為在95～100℃條件下超聲輔助（功率500 W）提取3 min。GPC分析結(jié)果表明，超聲輔助提取會造成鐵皮石斛多糖PDI值升高，表明超聲輔助提取在一定程度上造成了水溶性多糖鏈結(jié)構(gòu)的破壞。紅外光譜、剛果紅結(jié)合能力和單糖組分分析結(jié)果表明，超聲提取對多糖的一級結(jié)構(gòu)和螺旋結(jié)構(gòu)無明顯影響。本研究建立的超聲輔助熱水提取法高效快捷，避免了傳統(tǒng)的熱水回流方法的耗時、費力，且每次分析只能處理少量樣品等缺點，可應(yīng)用于鐵皮石斛多糖含量和單糖組成分析等試驗。對鐵皮石斛13個品種的莖和葉片水溶性多糖含量進行比較發(fā)現(xiàn)，莖中水溶性多糖含量高于葉片，且品種間存在較大差異。