魏 軒，王 琰，王兆彥，蒲巧生*

(1.蘭州大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.通化師范學(xué)院，吉林 通化 134002；3.蘭州大學(xué) 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

微流控芯片電泳分析速度快、試劑和樣品消耗量少，在基因分析[1-4]、藥物分析[5-6]、食品安全[7]和醫(yī)療診斷[8-9]等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。夾切進(jìn)樣是微流控芯片電泳常用的進(jìn)樣方式之一，該方式利用電場(chǎng)控制進(jìn)樣區(qū)帶的大小，使用方便[10]。但在微流控芯片電泳的實(shí)際操作中，該方式仍存在一些需要解決的問(wèn)題。首先，進(jìn)樣所需時(shí)間比較長(zhǎng)。在夾切進(jìn)樣過(guò)程中，樣品池中的待測(cè)物質(zhì)是在電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下遷移到十字或雙T結(jié)構(gòu)處，然后進(jìn)入分離通道完成分離。由于各待測(cè)物質(zhì)電遷移速率的差異[11-13]，為保證分析結(jié)果的可靠性，進(jìn)樣時(shí)間取決于有效電遷移速度最慢的成分[14-16]，耗時(shí)很長(zhǎng)(與分離所需時(shí)間相比)。其次，在多次進(jìn)樣-分離循環(huán)中，樣品可能被運(yùn)行緩沖液稀釋?zhuān)瑢?dǎo)致進(jìn)樣區(qū)帶中分析物濃度低于樣品中的實(shí)際濃度，且重現(xiàn)性變差。再次，隨著進(jìn)樣次數(shù)的增加，樣品廢液池的溶液逐漸增多，引起分離通道中的壓力流動(dòng)，造成峰形拖尾和重現(xiàn)性變差[17]。最后，進(jìn)樣階段施加在分離通道上的電壓會(huì)將前一次分離的樣品推回檢測(cè)位點(diǎn)，造成基線的抬升或漂移。Revermann等[18]通過(guò)綜述總結(jié)了解決這些問(wèn)題的方法。如Thomas等[10]提出了一種多次夾切進(jìn)樣的方法，但該進(jìn)樣方式需要6根電極，增大了系統(tǒng)的復(fù)雜程度；Lin等設(shè)計(jì)了帶有廢液移除功能的流通式芯片，重復(fù)進(jìn)樣3 h以上仍能保持很好的重復(fù)性[19]，但該方法需額外的注射泵，且樣品和試劑消耗量較大；Karlinsey等通過(guò)在PDMS-glass芯片上整合隔膜泵壓力注射來(lái)消除樣品的進(jìn)樣歧視[20]，但這種芯片制作過(guò)程比較復(fù)雜；Luo等在雙十字芯片上通過(guò)排空樣品廢液槽產(chǎn)生的液體靜壓力來(lái)實(shí)現(xiàn)樣品的進(jìn)樣，其中一個(gè)十字用來(lái)形成樣品塞，另一個(gè)十字用來(lái)對(duì)樣品塞進(jìn)行調(diào)控，該雙十字芯片能夠重復(fù)進(jìn)樣33次[21]。最近，Majarikar等利用帶有旁路結(jié)構(gòu)的微流控芯片來(lái)自動(dòng)補(bǔ)償微流控芯片電泳中壓力差引起的流動(dòng)，但該方法不適合離子強(qiáng)度較大的緩沖體系[22]。

本研究在進(jìn)樣和分離微通道中引入分叉結(jié)構(gòu)，增加額外的樣品廢液池和緩沖廢液池，利用液面差實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣微通道入口端和分離通道出口端溶液的連續(xù)更新，在不引入其它設(shè)備，也不會(huì)顯著加大芯片制作難度的前提下，有效解決了上述問(wèn)題，顯著提高了微流控芯片電泳的重復(fù)性，且有一定程度的樣品預(yù)分離能力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

研究所用四路程控高壓電源和激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器均由本課題組設(shè)計(jì)制作。其中高壓電源由4個(gè)高壓模塊(DW-P303-1AC，東文高壓電源(天津)股份有限公司)、繼電器和控制電路構(gòu)成，輸出電壓0～3 000 V可調(diào)。激光誘導(dǎo)熒光(LIF)檢測(cè)器由MBL-Ⅲ-473二極管泵浦全固態(tài)藍(lán)色激光器(長(zhǎng)春新產(chǎn)業(yè)光電技術(shù)有限公司)、顯微鏡物鏡(40×，重慶麥克光電儀器有限公司)、DM 505二向色鏡和BP 520長(zhǎng)通濾波器(沈陽(yáng)匯博光學(xué)技術(shù)有限公司)組成。檢測(cè)器采用共聚焦光路，激光照射到二向色鏡上(45°放置)，經(jīng)二向色鏡反射到物鏡，聚焦至微流控芯片檢測(cè)點(diǎn)，激發(fā)的熒光被同一物鏡收集，經(jīng)二向色鏡、長(zhǎng)通濾波器聚焦到CR105-01光電倍增管(北京濱松光子技術(shù)股份有限公司)前的針孔上。產(chǎn)生的光電流經(jīng)放大濾波后由USB-6008多功能采集卡采集，高壓電源和LIF檢測(cè)器均通過(guò)USB6008控制，用Labview編寫(xiě)的程序?qū)崿F(xiàn)高壓輸出控制和電泳譜圖的顯示、存儲(chǔ)、譜圖積分等功能。

草甘膦(GLYP)、草銨膦(GLUF)和氨甲基膦酸(AMPA)購(gòu)自德國(guó)Riedel-de Ha?n公司；異硫氰酸熒光素(FITC)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；硼砂、羥丙基纖維素(HPC)購(gòu)自上海Bio Basic公司；西蘭花購(gòu)于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)；其它試劑均為分析純。

1.2 樣品處理與衍生

稱(chēng)取5 g西蘭花，用榨汁機(jī)榨汁，汁液靜置1 min后取其上層清液，用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，取濾液放入冰箱中保存待用。樣品衍生參照文獻(xiàn)[23]進(jìn)行，衍生后立即進(jìn)行微流控芯片電泳分析。

1.3 微流控芯片的制作

研究所用環(huán)烯烴共聚物(COC)微流控芯片均采用改進(jìn)的金屬絲熱壓法制作，詳細(xì)制作流程參考文獻(xiàn)[24]，過(guò)程簡(jiǎn)要描述如下：①首先將COC片裁成6.0 cm×1.5 cm的長(zhǎng)方形小片，然后依次用1 mol/L NaOH、1 mol/L HCl、超純水清洗，于70 ℃烘箱中烘干；②將直徑80 μm的細(xì)銅絲按預(yù)定的方式固定在載玻片上，把COC片放在銅絲上面，再蓋一片載玻片，用3對(duì)長(zhǎng)尾票夾對(duì)稱(chēng)夾緊固定，置于140 ℃的烘箱中加熱25 min；③取出自然冷卻使COC片與載玻片分開(kāi)，將帶有銅絲的COC片放入硝酸溶液中；④待銅絲完全溶解后，水洗，空氣吹干，在COC片的適當(dāng)位置打孔(直徑3 mm)，用超純水和無(wú)水乙醇清洗；⑤將另一片COC片蓋在通道上，并將這兩片COC夾在兩片載玻片中，于122 ℃烘箱中加熱10 min完成兩片COC的封接；⑥在打孔位置粘上儲(chǔ)液池，并用COC的甲苯溶解液密封邊沿，即可得到所需的微流控芯片。

圖1 具有分叉微通道結(jié)構(gòu)的電泳芯片示意圖Fig.1 Schematic diagram of a microchip with branched microchannels

1.4 微流控芯片電泳分離

微流控芯片(圖1)的6個(gè)儲(chǔ)液池分別標(biāo)記為S(樣品池)、SW(樣品廢液池)、SW’(額外的樣品廢液池)、B(緩沖液池)、BW(緩沖廢液池)、BW’(額外的緩沖廢液池)，各液池中所加溶液體積分別為100、100、30、100、100、30 μL。進(jìn)樣階段中，SW池加400 V電壓，SW’池接地，B池和BW’池分別加140 V和80 V電壓來(lái)限制樣品區(qū)帶的寬度。分離階段，B池和BW’池的電壓切換為0 V和1 800 V，實(shí)現(xiàn)電泳分離。同時(shí)，SW池和SW’池的電壓切換為700 V和600 V，防止樣品滲漏進(jìn)入分離通道。

2 結(jié)果與討論

2.1 微流控芯片微通道設(shè)計(jì)思路

Crabtree等[17]早在2001年就報(bào)道了壓差引起的流動(dòng)對(duì)微流控芯片電泳重現(xiàn)性的影響，Revermann等[18]詳細(xì)討論了微流控芯片電泳面臨的問(wèn)題和解決方法。仔細(xì)調(diào)整各儲(chǔ)液池中的溶液體積、及時(shí)更換儲(chǔ)液池中的溶液是提高微流控芯片電泳重現(xiàn)性的重要途徑。由于電泳過(guò)程中各儲(chǔ)液的液面會(huì)隨時(shí)間變化，為保證分析結(jié)果的重現(xiàn)性，必須增加溶液更換的頻次，這勢(shì)必影響總的分析速度，也增加了微流控芯片電泳的操作難度，不利于其實(shí)際應(yīng)用。夾切進(jìn)樣是一種理想的微流控芯片電泳進(jìn)樣方法，但存在進(jìn)樣時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題。采用該方式連續(xù)進(jìn)樣分析時(shí)，進(jìn)樣階段施加在分離通道出口端的夾切電壓會(huì)將前次分離的分析物和樣品基體推回分離通道檢測(cè)位點(diǎn)，導(dǎo)致基線異常抬升，影響分析重現(xiàn)性。

為解決這些問(wèn)題，本研究在進(jìn)樣通道和分析通道末端引入了分叉結(jié)構(gòu)，增加了額外的樣品廢液池和緩沖廢液池(圖1)?；舅悸肥荢W’和BW’僅加入少量溶液(30 μL)，借助S和SW’、BW和BW’之間的液面差來(lái)維持連續(xù)流動(dòng)，4根電極分別加在B、BW’、SW、SW’儲(chǔ)液池中。溶液流向如圖2所示，在進(jìn)樣階段，由于電場(chǎng)的作用樣品從S與SW’之間的分叉點(diǎn)進(jìn)入進(jìn)樣通道流向SW，而S和SW’的液面差阻止了SW’中的溶液回流，分叉點(diǎn)始終為新鮮樣品(未被稀釋也未受電解影響)。同樣，BW的BW’的液面差也阻止了BW’中的溶液進(jìn)入分離通道，防止多次進(jìn)樣分離后廢液池中的樣品在進(jìn)樣時(shí)被夾切電壓反推進(jìn)入分離通道引起基線的異常抬升。分離階段，在電場(chǎng)的作用下樣品區(qū)帶從進(jìn)樣十字進(jìn)入分離通道向緩沖廢液池遷移，由于BW和BW’的液面差，使得分離過(guò)程中的廢液全部流向BW’，保證了分離通道末端始終為新鮮緩沖溶液。S和SW’之間分叉點(diǎn)的顯微熒光照片顯示，在進(jìn)樣階段樣品可以穩(wěn)定進(jìn)入進(jìn)樣通道，而分離階段樣品不會(huì)進(jìn)入進(jìn)樣通道(圖3)。需要說(shuō)明的是，S和SW’之間的流動(dòng)不會(huì)顯著增加樣品的消耗(測(cè)量得出的S和SW’之間樣品的流速僅為3.6～5.2 μL/h)。

采用具有分叉結(jié)構(gòu)微通道的芯片進(jìn)行電泳分離，多次重復(fù)進(jìn)樣未觀察到基線抬升的現(xiàn)象，說(shuō)明這種芯片通道設(shè)計(jì)可行。

圖2 進(jìn)樣(A)和分離(B)階段通道內(nèi)的溶液流向示意圖Fig.2 Schematic diagram of flow direction during injection(A) and separation(B) phases

2.2 進(jìn)樣時(shí)間與進(jìn)樣通道長(zhǎng)度的影響

以FITC標(biāo)記的有機(jī)磷除草劑及其降解產(chǎn)物為模型，在帶有分叉結(jié)構(gòu)微通道的芯片上，考察了進(jìn)樣時(shí)間對(duì)出峰個(gè)數(shù)的影響(圖4A)。結(jié)果顯示，進(jìn)樣時(shí)間為30 s時(shí)即可保證3種除草劑出峰，進(jìn)一步延長(zhǎng)進(jìn)樣時(shí)間衍生試劑FITC的峰才會(huì)出現(xiàn)，這意味著可通過(guò)控制進(jìn)樣時(shí)間來(lái)達(dá)到簡(jiǎn)化譜圖的目的。為了進(jìn)一步證實(shí)利用該方法簡(jiǎn)化譜圖的可行性，采用FITC衍生的西蘭花汁液作為樣品，在同樣條件下測(cè)試了進(jìn)樣時(shí)間的影響(圖4B)，發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣時(shí)間為45 s時(shí)，樣品中大量的基體物質(zhì)進(jìn)入分離通道出峰，譜圖非常復(fù)雜，進(jìn)樣時(shí)間為35 s時(shí)譜圖相對(duì)簡(jiǎn)單，進(jìn)樣時(shí)間為30 s則僅有3種有機(jī)磷化合物的峰。因此通過(guò)選擇合適的運(yùn)行緩沖介質(zhì)，盡可能使待測(cè)組分在前面出峰，同時(shí)控制進(jìn)樣時(shí)間，可以達(dá)到簡(jiǎn)化譜圖的目的。這樣也避免了大量樣品基體進(jìn)入分離通道，減小了分離通道污染的可能性。

將LIF檢測(cè)位點(diǎn)置于進(jìn)樣通道時(shí)所獲得的譜圖也證實(shí)了這一點(diǎn)，對(duì)于FITC衍生的3種有機(jī)磷混合物，譜圖呈現(xiàn)兩個(gè)明顯的平臺(tái)，說(shuō)明進(jìn)樣通道中發(fā)生了分離(迎頭模式)(圖5)。

圖5 進(jìn)樣通道檢測(cè)信號(hào)Fig.5 Fluorescent signal detected at the sampling microchannelsample:FITC labeled GLYP,AMPA and GLUF；detected at a point of 0.4 cm from the cross

實(shí)驗(yàn)還考察了進(jìn)樣通道長(zhǎng)度(從分叉點(diǎn)到十字)為0.5、0.8、1.0、1.3、1.5 cm的微流控芯片的分離效果，發(fā)現(xiàn)不同長(zhǎng)度的微流控芯片均可實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)化譜圖的目的，使用時(shí)可靈活選擇。S池及SW’池至分叉點(diǎn)的距離相等，均為1 cm,受儲(chǔ)液池布局限制，未嘗試其它長(zhǎng)度。

圖6 連續(xù)進(jìn)樣分離120次的電泳譜圖Fig.6 Electropherograms of a consecutive injection and separation of organophosphorus herbicides(n=120)analytes are same as those in Fig.4;insert:enlarged electropherograms of 11,51 and 91st injection

2.3 重復(fù)性

采用這種具有分叉結(jié)構(gòu)的微流控芯片時(shí)，由于電極放置在BW’池，既使長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行也不會(huì)因電解產(chǎn)物影響分離通道中運(yùn)行緩沖液組成，這有利于提高電泳分析的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)采用該芯片可以至少進(jìn)行40次連續(xù)進(jìn)樣分析，40次后更換各儲(chǔ)液池中的溶液，即可開(kāi)始下一輪連續(xù)測(cè)定。圖6是120次連續(xù)分析的譜圖，以氨甲基磷酸的峰高計(jì)算得到的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.56%。在本實(shí)驗(yàn)條件下，每運(yùn)行40次更換溶液的原因是研究所用微流控芯片的儲(chǔ)液池體積較小(150 μL)，緩沖液池中的電解會(huì)改變運(yùn)行緩沖液的pH值，溶液的揮發(fā)也會(huì)改變緩沖液濃度，因此采用更大的緩沖液池應(yīng)該能夠增加穩(wěn)定連續(xù)進(jìn)樣的次數(shù)。

3 結(jié) 論

本研究在進(jìn)樣通道和分離通道末端引入分叉結(jié)構(gòu)，增加額外的樣品廢液池和緩沖廢液池，并在樣品池與額外的樣品廢液池、緩沖廢液池和額外的緩沖廢液池之間維持一定的液面差，保持進(jìn)樣通道和分離通道末端溶液的持續(xù)更新，可有效縮短多次連續(xù)進(jìn)樣分離時(shí)的進(jìn)樣時(shí)間，消除基線異常抬升等問(wèn)題，顯著改善了夾切進(jìn)樣微流控芯片電泳連續(xù)進(jìn)樣分析的重現(xiàn)性。由于電極置于額外的樣品廢液池，避免了電解對(duì)樣品的影響。對(duì)于待測(cè)物提前出峰的情況，還可以通過(guò)控制進(jìn)樣時(shí)間來(lái)避免大量的樣品基體成分進(jìn)入分離通道，減小了分離通道污染的可能性，簡(jiǎn)化了譜圖。方法可提高微流控芯片電泳的可靠性，對(duì)促進(jìn)其實(shí)際應(yīng)用有一定的參考意義。