魯弘骎，陳暉，黃頡剛

(廣西醫(yī)科大學研究生院,廣西 南寧 530022)(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年消化內(nèi)科，廣西 南寧 530022)(廣西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院 廣西艾滋病防治研究重點實驗室，廣西 南寧 530022)

結直腸息肉(colorectal polyps)是指任何突出于結直腸管腔內(nèi)的隆起性病變,它具有潛在進展為結直腸癌的風險[1,2]。在中國有1.4%～20.4%的結直腸息肉患者會發(fā)生惡變[3]。已有的研究認為結直腸癌和結腸息肉患者的腸道菌群存在結構和功能的改變等潛因[4]，腸道息肉病的發(fā)生與進展可能與腸道菌群失穩(wěn)態(tài)有關[5]，腸道息肉病的特征包括腸道菌群紊亂與腸黏膜屏障功能失調(diào)，提示腸道菌群的結構與豐度的變化在結直腸息肉的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用[6]。雖然,腸道微生物研究開展得較早，但基于年齡因素對結直腸息肉患者腸道菌群結構及多樣性的研究卻較少。筆者收集廣西南寧地區(qū)結直腸息肉患者7例以及腸鏡檢查結果為陰性人群47例的糞便樣本，應用細菌16S rDNA高通量基因測序技術，通過對測序數(shù)據(jù)、菌群差異性及相對豐度差異性的分析，基于年齡為主要風險因素,探尋腸道息肉顯著相關的菌群結構及豐度的變化，為腸道息肉發(fā)生的風險評估及臨床治療提供科學依據(jù)與研究思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為2018年6月至2019年1月在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院行常規(guī)腸鏡檢查的患者，包括結直腸息肉患者(術前)以及腸鏡檢查結果為陰性的人群。息肉病例(7例)均符合1982年全國結直腸癌協(xié)作組病理學者提出的息肉診斷標準,其中男性5例,女性2例,年齡31～82歲。腸鏡陰性人群指排除結直腸息肉、腫瘤以及無明顯的炎性腸道疾病者，作為對照組。對照組47例中男性34例，女性13例，年齡20～82歲。對照組按5∶2的男、女比例再篩分為對照一組(年齡≥40歲，14例)、對照二組(年齡<40歲，14例)。篩分原則參照息肉組的年齡與性別結構、年齡遞增大致均衡、采樣時段相同。各組性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。②排除標準：入組前2周內(nèi)曾使用過抗生素、有其他消化道疾病、免疫性疾病或惡性腫瘤病史以及已服用息肉術前準備藥物(息肉組)。此項研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，與所有納入的研究對象簽署了知情同意書，并以問卷調(diào)查方式獲取患者相關信息。

1.2 樣本采集

①準備2只采樣管用于每例樣本的采集(其中1只管含DNA穩(wěn)定劑，標記包括姓名、性別、組別、樣本編號)等關鍵信息；②采集糞便：用含DNA穩(wěn)定劑的采樣管采集兩顆黃豆粒大小的樣本，分別含1倍及2倍量的樣本；③樣本保存：樣本采集完成立即存入冰盒中，然后置入專業(yè)冰箱中保存；④信息記錄：詳細記錄采集對象的與本研究相關的信息。

1.3 基因組DNA提取和16S rDNA測序

根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA,U.S.)說明書進行總DNA抽提。提取的DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。PCR擴增用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)、806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對V4可變區(qū)進行PCR擴增。Illumina Miseq 測序：①2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物；②AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 進行純化；③Tris-HCl洗脫；④2%瓊脂糖電泳檢測QuantiFluorTM-ST (Promega, USA) 進行DNA定量檢測。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺 (Illumina, San Diego,USA)標準操作規(guī)程，將純化后的擴增片段構建PE 2*300的文庫。

1.4 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計學方法

1)生物信息學方法。原始測序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控,使用FLASH軟件拼接：設置50bp的窗口，barcode精確匹配；引物允許2個堿基的錯配，去除模糊堿基，根據(jù)重疊堿基overlap將兩端序列進行拼接；應用UPARSE軟件(version 7.1)在97%的相似度對序列進行OTU(Operational taxonomic units)聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體；利用RDP classifier各條序列進行物種分類注釋；比對Silva數(shù)據(jù)庫(SSU123)，設置比對閾值為70%。

2)數(shù)據(jù)分析。①使用I-Sanger云平臺進行高通量數(shù)據(jù)分析。門、科水平的α指數(shù)基于97%的序列相似性，屬水平的α指數(shù)基于95%的序列相似性；②物種差異分析使用秩和檢驗法：指數(shù)組間差異檢驗取95%可信區(qū)間，P-value(P值)為假定值，用于判斷原始假設是否正確(0.01

圖1 息肉組與對照組的Venn圖

2 結果

2.1 測序數(shù)據(jù)

息肉組與對照組總54個樣本共獲得1716985條可用的高質(zhì)量序列，序列平均長度為252bp，所有樣本文庫的覆蓋率達97%以上，表明各樣本的測序量已達飽和。以97%相似度聚類，獲558個OTU(圖1)：息肉組共獲272個 OTU，對照組共獲541個OTU。

2.2 Alpha多樣性分析結果

Alpha多樣性是指一個特定區(qū)域內(nèi)的多樣性，是一項反映物種豐富度和均勻度的綜合指標。物種多樣性的分析，是基于OTU種類和豐度計算Chao、Shannon、Simpson、Sobs(圖2)等指數(shù)。

圖2 息肉組與對照組的Alpha多樣性指數(shù)分析

圖3 息肉組與對照組的Sobs指數(shù)對比

Chao指數(shù)反映樣本中物種的豐度，即OTU的數(shù)量。Shannon和Simpson指數(shù)用于反映群落的多樣性，包括物種豐度和均勻度，Shannon指數(shù)值越大、Simpson指數(shù)值越小，物種多樣性就越高。從圖2中可看出,息肉組的Chao指數(shù)較對照組有下降趨勢，即息肉組物種豐度總體上比對照組略低，但P=0.065,無統(tǒng)計學意義；息肉組的Shannon指數(shù)與對照組接近；息肉組的Simpson指數(shù)與對照組相比,平均值比較接近。但從Sobs指數(shù)對比圖(圖3)中可看出，對照組的物種種類較明顯地多于息肉組。

2.3 息肉組與對照組腸道菌群差異性及相對豐度對比

息肉組與對照組的樣本數(shù)比為7∶47。對比結果由OTU的Venn結果圖以及在門、科屬水平上的秩和測試條結果圖中獲得。

1)息肉組與對照組的腸道菌群構成不同。從OTU的 Venn結果圖(圖1)可以看出,息肉組和對照組樣本的腸道菌群構成存在差異,即息肉組菌群豐度較對照組有顯著降低。

2)應用秩和檢驗方法，分別在門、科、屬水平上，對2組的腸道菌群豐度作對比分析。在門水平上，息肉組的梭桿菌門(Fusobacteria)相對豐度顯著低于對照組(圖4(a))；在科水平上，息肉組伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、梭桿菌科(Fusobacteriaceae)、產(chǎn)堿桿菌科(Alcaligenaceae)相對豐度顯著低于對照組(圖4(b))；在屬水平上，息肉組的洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia-Paraburkholderia)相對豐度顯著低于對照組(圖4(c))。

2.4 對照組不同年齡段腸道菌群結構與息肉組的相關性分析

本次研究的息肉組平均年齡(62.71±12.50)歲，對照一組(55.00±13.90)歲，對照二組的平均年齡(32.00±17.99歲)，息肉組平均年齡最大，對照二組最小。對照組篩分以40歲為界，是基于腸道息肉發(fā)病與年齡及性別因素的關系。

圖4 息肉組與對照組在門、科、屬水平上物種的相對豐度比較

1)息肉組與對照一組、對照二組的Alpha多樣性對比結果見圖5，P=0.065，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2)在科水平上，息肉組與對照一組、對照2組的對比結果見圖6(a)。維榮球菌科(Veillonellaceae)(P=0.02623)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)(P=0.04538)的相對豐度差異具有統(tǒng)計學意義。其中,息肉組的相對豐度最低。

圖5 息肉組與對照一組、對照二組的Alpha多樣性對比

3)在屬水平上，息肉組與對照一組、對照2組的對比結果見圖6(b)。洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia-Paraburkholderia)(P=0.01851)、巨單胞菌屬(Negamonas)(P=0.03244)的相對豐度差異具有統(tǒng)計學意義。其中,息肉組的相對豐度最低。

圖6 息肉組與對照一組、對照二組的菌群在科、屬水平上的豐度差異對比

通過在科、屬水平上豐度的差異對比(圖6)發(fā)現(xiàn),與對照二組相比，息肉組與對照一組的維榮球菌科(Veillonellaceae)、巨單胞菌屬(Megamonas)相對豐度明顯下降，且具有一致性，提示隨著年齡增大結直腸息肉發(fā)病風險也增大。

3 討論

結直腸息肉為來源于黏膜上皮的局限性隆起[7]，包括增生性和腺瘤性息肉[8]，其中腺瘤性息肉約占結直腸息肉的70%，腺瘤性息肉惡變比例占80%以上[1]。結直腸息肉發(fā)病的危險因素包括：人口學因素、遺傳因素、飲食因素、生活行為習慣、代謝性疾病、腸道微生物失穩(wěn)態(tài)等[9]。結直腸息肉發(fā)病風險與年齡因素密切相關。Liebennan等[10]對美國327785名患者的資料研究結果提示腸息肉的發(fā)病風險隨年齡增長而增大。結直腸息肉的發(fā)病率隨年齡上升[11],小于40歲人群息肉檢出率為20%～30%,而40歲以上人群檢出率則上升至40%～50%；老年人大腸息肉檢出率、癌變率均明顯高于青中年，并隨著年齡增長有增高的趨勢[9]。另據(jù)黃小榮等[12]對我國浙北地區(qū)5320例接受結腸鏡檢查人群的研究，發(fā)現(xiàn)男性結直腸息肉病患多于女性；41～60歲為息肉高發(fā)年齡段[10]。不同年齡段人群的腸道微生態(tài)存在差異[13～15]。因此，研究結直腸息肉須綜合考慮上述因素。既往的研究多側重于結直腸癌與腸道息肉的相關性研究，該研究基于年齡因素，按發(fā)病風險依次遞增的人群設計對照組的分組，使差異菌群辨別更為準確。息肉組與對照組的Alpha多樣性研究結果：梭桿菌科、伯克氏菌科、洋蔥伯克霍爾德菌的相對豐度較對照組下降，但該研究的息肉組的樣本數(shù)似欠足夠,有待今后足量樣本的研究結果予以佐證。利用秩和檢驗法獲得的統(tǒng)計學意義在于: 韋榮球菌科、巨單胞菌屬相對豐度下降與結直腸息肉有關，提示隨著年齡增大結直腸息肉發(fā)病風險也增加。下一步研究以下2個方面需加強：①息肉病例的病理分類；②腸鏡陰性對照組的腸息肉發(fā)病的危險因素納入。