黃 興，柴志欣，信金偉，王 會，王吉坤，姬秋梅，鐘金城

(1.西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏 拉薩 850009)

黃牛作為一種優(yōu)質(zhì)畜種，為人類提供肉、奶、毛皮、役力等畜產(chǎn)品，中國黃牛品種資源十分豐富[1]，在中國畜牧業(yè)生產(chǎn)及地區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展中發(fā)揮重要作用.針對中國黃牛遺傳起源、系統(tǒng)進化，國內(nèi)外諸多專家學者做了大量研究，《中國牛品種志》中按照地理分布將中國黃牛大體劃分為南方黃牛、中原黃牛和北方黃牛[2].黃牛在自然選擇下又分為有峰和無峰兩種形態(tài)，有峰牛叫做瘤牛，大量垂皮，瘤駝，具有抗熱特性；無峰牛皮膚多毛，能抗寒，所以因氣候差異，中國南方多瘤牛，北方多無峰牛.與國外相比，中國瘤牛瘤駝偏小，而印度瘤牛肩峰高大，差異較大[3].西藏地區(qū)海拔高，缺氧，生活在該地區(qū)的物種適應(yīng)性極強，以黃牛、奶牛、牦牛為代表的物種具有很高研究價值，當?shù)卣七M黃牛改良項目，不斷加大改良力度，使得養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)成為農(nóng)牧民增收致富的重要方式[4]，伴隨著改良進程的加速，出現(xiàn)了雜交牛后代適應(yīng)性差、產(chǎn)奶量低、繁殖率偏下等問題[5]. 因此，通過分析西藏地區(qū)各品種牛遺傳多樣性及系統(tǒng)進化為優(yōu)良品種選育，遺傳穩(wěn)定性增強，及西藏地區(qū)遺傳保種工作提供科學依據(jù).

動物遺傳多樣性和系統(tǒng)進化分析方法較多，主要包括形態(tài)、細胞、生化、分子等遺傳標記[6]，而動物線粒體DNA(mtDNA)常被作為研究物種遺傳進化的一個分子標記[7-9]，它是一種具有簡單雙鏈閉合環(huán)型的DNA 分子，除細胞核基因組外唯一核外遺傳物質(zhì)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定屬母系遺傳，在不同群體內(nèi)具有廣泛的多態(tài)性.作為mtDNA 控制區(qū)的D-loop 區(qū)，具有變異快和多態(tài)性豐富等特點，是研究遺傳多樣性、亞科內(nèi)物種間系統(tǒng)發(fā)育和進化關(guān)系的重要區(qū)域. 牛mtDNA 由一段910 bp 左右的D-loop 區(qū)以及37 個基因構(gòu)成，總長度約為16 338 bp[10]. Loftus[11]等在兩種獨立馴養(yǎng)牛起源和分類證據(jù)中根據(jù)D-loop 區(qū)差異將獨立馴養(yǎng)牛劃分成瘤牛和普通牛兩種類型.Bailey[12]等通過分析牛D-loop 區(qū)發(fā)現(xiàn)世界牛起源地.Yu[13]等在對12 個南方品種牛mtDNA 研究中，揭示了瘤牛和普通牛是南方黃牛的主要起源. 雷初朝[14]等通過8 個黃牛品種mtDNA 的分析明確了普通牛和瘤牛的起源方向.賴松家[15]等通過四川5 個黃牛品種mtDNA D-loop 區(qū)的研究，共發(fā)現(xiàn)28 種單倍型，由普通黃牛和瘤牛兩種類型組成.張桂香[16]等分析中國地方黃牛品種mtDNA 的遺傳變異情況，表明中國黃牛品種遺傳多樣性豐富.汪琦[17]等通過對三江黃牛mtDNA 的研究，發(fā)現(xiàn)三江黃牛為普通牛和瘤牛共同進化而來. 除此之外，鐘金城[18]等、李祥龍[19]等、黃勇富[20]等對其他物種如牦牛、山羊、豬等也做了相應(yīng)mtDNA 限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性研究. 西藏地區(qū)擁有豐富的地方品種，因技術(shù)和交通等不利因素影響，不同牛品種間親緣關(guān)系和遺傳多樣性尚未系統(tǒng)、全面得到闡釋. 本研究旨在對西藏地區(qū)部分黃牛品種mtDNA D-loop 區(qū)進行研究，為西藏黃牛、奶牛遺傳多樣性評估和選育提供科學依據(jù)，所涉及的黃牛群體個體稀少，部分黃牛群體幾乎處于瀕危狀態(tài)，工作人員采樣困難，未能采集到大范圍的樣本，故采集樣本量較少.

1 材料與方法

1.1 材料

西藏3 個黃牛群體和1 個奶牛品種，分別是林芝察隅鎮(zhèn)巴美牛(ZJ)、林芝察隅鎮(zhèn)當?shù)赝练N牛(TZ)、曲尼帕娟姍牛(JS)、亞東縣駝峰牛(TF)，均選取4.5 歲健康雌性個體，采集耳組織，75% 乙醇保存，帶回實驗室，-80 ℃保存?zhèn)溆?樣品采樣記錄見表1.

表1 牛樣品采樣記錄Table 1 Cattle sample sampling record

1.2 基因組DNA 的提取及檢測

利用動物組織基因組DNA 提取試劑盒(Tian Gen生物技術(shù)公司)提取DNA，紫外分光光度計檢測其濃度，1.5%的瓊脂糖檢測，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.3 引物設(shè)計和PCR 擴增

根據(jù)雷初朝[14]等公布的特異性引物，對4 個群體牛mtDNA D-loop 區(qū)進行擴增，引物由英濰捷基(上海)生物技術(shù)有限公司合成. 上游引物為:5’-CTGCAGTCTCACCATCAACC -3’， 下 游 引 物 為: 5’ -GGGGTGTAGATGCTTGC-3’.PCR 擴增體系為25 μL:ddH2O 9.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板1 μL、Dream Taq Green PCR Master Mix(2 ×) 12.5 μL.PCR反應(yīng)程序為:95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，57.4℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.

經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物后用凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增情況，并保存結(jié)果. 擴增成功個體送上海生物工程技術(shù)有限公司測序.

1.4 數(shù)據(jù)處理

測序結(jié)果應(yīng)用DNAMAN 軟件與原始序列進行比對校正，Clustal X 1. 83、MegAlign、BioEdit 等軟件進行序列比對.利用MEGA 5. 0、DnaSP 4. 0 等軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，以及計算堿基組成、核苷酸多態(tài)性、單倍型多態(tài)性等遺傳指標. 利用MEGA6 軟件進行起源進化關(guān)系分析，并添加2 頭歐洲普通牛(GenBank 登錄號:L27712，GenBank 登錄號:L27716)，2 頭印度瘤牛(GenBank 登錄號:L27722，L27732)，1 頭非洲瘤牛(GenBank 登錄號:L27728). 采用鄰接法(NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹).

2 結(jié)果

2.1 mtDNA D-loop 區(qū)核苷酸序列及其遺傳多樣性

將測序結(jié)果進行人工比對、剪切，得到4 個群體對應(yīng)的mtDNA D-loop 區(qū)，18 個個體D-loop 區(qū)長度分布在892 bp ～912 bp，品種間存在長度差異，4 個群體A、G、T、C、A ＋T、C ＋G 的平均含量約為:32.70%、13.80%、28.80%、24.70%、61.50%、38.50%，表明西藏黃牛和奶牛D-loop 序列富含A ＋T 堿基，此外Dloop 區(qū)末端發(fā)現(xiàn)一段連續(xù)的堿基C.

西藏3 個黃牛群體和一個奶牛品種中，共檢測到顛換、轉(zhuǎn)換、插入、缺失以及顛換和轉(zhuǎn)換共存同一位點等5 種突變類型(圖1).利用生物軟件DNASPv5 比對，因序列間對齊間隙或缺少數(shù)據(jù)等情況存在，共缺失30 bp，總多態(tài)位點為125 個，單倍型數(shù)量為17，突變總數(shù)達到132，平均單倍型多樣性約為0.992，平均核苷酸多樣性約為0.039，平均核苷酸差異數(shù)約為34.767.其中單一多態(tài)位點25 個，包含24 個單堿基突變和一個三堿基突變，位置分別位于:25 110 117 135 152 198 259 260 266 286 303 306 336 374 409 410 519 588 712 739 750 831 875 911 和204.簡約信息位點為100 個，包含94 個兩堿基突變和6 個三堿基突變的簡約信息位點，分別位于:1 4 27 28 38 40 55 56 63 80 82 87 90 124 125 130 131 134 148 153 157 158 160 163 165 166 168 172 174 183 203 231 256 258 267 268 277 283 292 294 295 304 312 318 320 322 323 325 326 327 329 331 332 335 347 348 351 357 406 415 416 439 440 443 458 459 466 471 475 505 511 512 513 557 655 715 718 721 722 728 755 773 782 798 799 805 818 829 842 846 850 865 877 879 和162 170 284 319 912 913.

將4 個群體分離，單獨比對發(fā)現(xiàn)，巴美牛單倍型數(shù)為4，單倍型多樣性(Hd)為1.000；當?shù)赝练N牛單倍型數(shù)為3，單倍型多樣性(Hd)為1.000；娟姍牛單倍型數(shù)為5，單倍型多樣性(Hd)為1.000；駝峰牛單倍型數(shù)為5，TF15 與TF16 共享一種單倍型，單倍型多樣性(Hd)為0.933，巴美牛，娟姍牛，當?shù)赝练N牛單倍多樣性最高，駝峰牛單倍型多樣性最低，具體見表2.

圖1 西藏牛亞科部分群體mtDNA D-loop 序列比對Fig.1 The mtDNA D-loop sequence alignment of some subfamilies of cattle in Tibet

表2 西藏牛亞科部分群體的單倍型多樣性Table 2 Haplotype diversity of some subfamilies of cattle in Tibet

巴美牛mtDNA D-loop 區(qū)轉(zhuǎn)換45 個，顛換3 個，插入及缺失為3 個，分別占4.9%、0.3%、0.3%，核苷酸多樣性(Pi)為0.03528；當?shù)赝练N牛mtDNA D-loop區(qū)轉(zhuǎn)換89 個，顛換15 個，插入及缺失為11 個，并存在一處轉(zhuǎn)換和顛換共存位點，分別占9.9%、1.7%、1.2%、0.1%，核苷酸多樣性(Pi)為0.07929；娟姍牛mtDNA D-loop 區(qū)轉(zhuǎn)換48 個，顛換4 個，插入及缺失為7 個，并存在1 處轉(zhuǎn)換和顛換共存位點，分別占5.3%、0.4%、0.7%、0.1%，核苷酸多樣性(Pi)為0.03665，Tajima's D 中性檢驗D 值為1.31274(P ＞0.1)，不顯著；駝峰牛mtDNA D-loop 區(qū)轉(zhuǎn)換3 個，顛換3 個，插入及缺失為4 個，并存在1 處轉(zhuǎn)換和顛換共存位點，分別占0. 3%、0. 3%、0. 4%、0. 1%，核苷酸多樣性(Pi)為0.00353，Tajima's D 中性檢驗D 值為-0.51093(P ＞0.1)，不顯著，表明娟姍牛和駝峰牛可能未出現(xiàn)群體擴張模式.4 個群體，核苷酸多樣性變化范圍在0.00353 ～0.07929，當?shù)赝练N牛的核苷酸多樣性最高，巴美牛和娟姍牛核苷酸多樣性差異不大，駝峰牛的核苷酸多樣性最低.其結(jié)果如表3、表4.

表3 西藏牛亞科部分群體mtDNA D-loop 核苷酸多態(tài)性Table 3 Nucleotide polymorphism of mtDNA D-loop of some subfamilies of cattle in Tibet

表4 西藏牛亞科部分群體mtDNA D-loop 區(qū)平均核苷酸變異率(%)Table 4 Average nucleotide variation rate of mtDNA D-loop region of some subfamilies of cattle in Tibet(%)

2.2 西藏牛亞科部分群體系統(tǒng)進化關(guān)系分析

利用MegAlign 軟件對4 個群體mtDNA D-loop 區(qū)兩兩比對發(fā)現(xiàn)(見圖2)，4 個群體牛歧異度在0.1%～11.9%之間變化，同源性在88.7% ～99.9%；駝峰牛和巴美牛的歧異度最小為0.1%，同源性為99.9%，推測巴美牛與駝峰牛有相似血統(tǒng)；娟姍牛和當?shù)赝练N牛的歧異度最大，達到11.9%，同源性為88.7%，表明當?shù)赝练N牛作為當?shù)毓逃械娜后w和外來的娟姍牛品種有著明顯的遺傳分化.

圖2 西藏牛亞科部分群體mtDNA D-loop 區(qū)歧異度及差異百分比Fig.2 Divergence and percent identity of mtDNA D-loop region of some subfamilies of cattle in Tibet

利用DNAsp 軟件進行比對發(fā)現(xiàn)，4 個西藏牛亞科群體mtDNA D-loop 區(qū)序列由17 種單倍型組成，其中駝峰牛3 號和駝峰4 號共享一種單倍型；其余每一頭對應(yīng)一種單倍型，表明西藏牛亞科群體mtDNA 遺傳多樣性豐富.由圖3 可知，17 種單倍型大致可以分為三大類，第一類包括2 號當?shù)赝练N牛(TZ2)和3 號當?shù)赝练N牛(TZ3)；第二類包括3、4 號巴美牛，2、4、5 號娟姍牛和兩種印度瘤牛，且發(fā)現(xiàn)Sahiwal 牛(L27732)與3、4 號巴美牛單倍型更相似，Hariana 牛(L27722)與2 號娟姍牛單倍型較相似；第三類將剩余單倍型個體和2 頭歐洲普通牛和1 頭非洲瘤牛劃歸為一大類，其中非洲瘤牛和娟姍牛3 號單倍型更一致.4 個群體牛系統(tǒng)發(fā)育進化樹與同源性比對情況基本一致，除巴美牛外，其余群體自成一類. 娟姍牛與當?shù)赝练N牛以及駝峰牛親緣關(guān)系較遠，但巴美牛與娟姍牛、駝峰牛、當?shù)赝练N牛分歧時間較近.

圖3 西藏牛亞科部分群體mtDNA D-loop 全序列NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹(普通牛與瘤牛為對照)Fig.3 NJ tree of mtDNA D-loop region sequences of some subfamilies of cattle in Tibet(Bos taurus and Bos indicus as control)

3 討論

3.1 mtDNA D-loop 區(qū)遺傳多樣性分析

具有世界屋脊之稱的青藏高原生物遺傳資源豐富，保護和有效利用青藏高原遺傳資源意義重大，而遺傳多樣性研究有助于了解對不同品種或類群進化歷史以及生物地位. 本研究對林芝當?shù)赝练N牛、巴美牛以及來自曲尼帕的娟姍牛，亞東縣駝峰牛4 個群體mtDNA D-loop 區(qū)研究發(fā)現(xiàn)，所有個體D-loop 區(qū)均在910 bp 左右，與Loftus[11]、Bailey[12]、雷初朝[14]、賴松家[15]張桂香[16]等測得黃牛mtDNA D-loop 區(qū)長度接近.在D-loop 區(qū)末端發(fā)現(xiàn)一段連續(xù)的堿基C，與Rand[21]、Anderson[10]、Hauswirth[22]等發(fā)現(xiàn)脊椎動物mtDNA D-loop 區(qū)包含一段連續(xù)的堿基為中止序列的結(jié)果一致.統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，西藏牛亞科部分群體mtDNA Dloop 區(qū)富含A ＋T 堿基，這與張桂香[16]、林瑞意[23]分別對我國部分黃牛品種線粒體D-loop 區(qū)遺傳多樣性與起源分化研究和貴州務(wù)川黑牛線粒體DNA D-loop全序列分析中發(fā)現(xiàn)D-loop 區(qū)富含A、T 堿基的結(jié)果一致，符合線粒體DNA D-loop 區(qū)多A ＋T 堿基的特性.

研究發(fā)現(xiàn)，18 個個體共發(fā)現(xiàn)17 種單倍型，單倍型數(shù)占總檢個體數(shù)的94.4%，表明其遺傳多樣性豐富.4個群體突變類型主要以轉(zhuǎn)換為主，大量研究表明線粒體DNA 在進化過程中，轉(zhuǎn)換頻率高于顛換.在突變類型中，發(fā)現(xiàn)了同一位點存在轉(zhuǎn)換和顛換共存現(xiàn)象，這在雷初朝等對中國部分黃牛品種mtDNA 遺傳多態(tài)型研究中已報道[14]，說明不同黃牛品種mtDNA 存在進化保守性及突變相似性. 4 個群體發(fā)現(xiàn)大量突變位點，推測與西藏海拔、光照強度等自然環(huán)境具有一定關(guān)系，環(huán)境誘變，紫外輻射均可誘發(fā)突變，西藏林芝平均海拔3 100 m，西藏亞東縣平均海拔在3 400 m，西藏曲尼帕位于拉薩，其平均海拔更是在3 600 m 左右，以上地區(qū)氣壓低，紫外線輻射強，長期生活在此環(huán)境，易發(fā)生突變積累. 當?shù)赝练N牛和巴美牛因樣品數(shù)量較少，未能進行Tajima'D 中性檢驗，娟姍牛Tajima's D 值為1.31274，不顯著(P ＞0.1)，駝峰牛Tajima's D值為-0.51093，不顯著(P ＞0.1)，均符合中性進化，未出現(xiàn)過群體擴張或瓶頸效應(yīng)現(xiàn)象.種群增長曲線表明:食物和空間充足及無敵害等理想條件下，數(shù)量會連續(xù)增加，根據(jù)相應(yīng)的報道顯示雪災(zāi)是西藏最常見的自然災(zāi)害，常造成牲畜死亡[24-25]，作為家養(yǎng)牛，排除敵害因素，漫長的冬季，難以持續(xù)有效補飼可能制約了種群發(fā)展.平均核苷酸多樣性為0.039，比張桂香[16]研究我國部分黃牛(Pi:0.0227)和汪琦[17]報道三江黃牛(Pi:0.00625)的平均核苷酸多樣性均要高，這表明西藏黃牛具有豐富的遺傳多樣性.

3.2 西藏牛亞科部分群體的系統(tǒng)進化關(guān)系

西藏黃牛作為農(nóng)牧區(qū)的主要畜種，體型偏小，生長發(fā)育緩慢，生產(chǎn)性能偏低，但抗逆性強，隨著選育技術(shù)日益成熟，陸續(xù)出現(xiàn)一些改良品種，其遺傳多樣性研究受到人們密切關(guān)注.研究調(diào)查分析不同品種之間的親緣關(guān)系、起源進化有助于合理利用和保護遺傳資源.將所有個體mtDNA D-loop 區(qū)進行比對發(fā)現(xiàn)，當?shù)赝练N牛和娟姍牛歧異度最大，同源性僅為88.7%. 娟姍牛作為外來引進品種，而當?shù)赝练N牛作為當?shù)毓逃衅贩N，本身親緣關(guān)系較其他遠. 以2 頭歐洲普通牛，1頭非洲瘤牛，2 頭印度瘤牛作為對照，采用鄰接法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，4 個品種中娟姍牛和部分巴美牛均和兩種瘤牛類型歸為一類，西藏其他牛種不含有任一瘤牛單倍型，均為普通牛，這與張桂香[16]、陳智華[26]、羅勇發(fā)[27]等證明西藏牛為普通牛類型觀點一致. 土種牛2 號和土種牛3 號單獨歸為一類，表明來自林芝下察隅鎮(zhèn)的當?shù)赝练N牛受到其他牛種影響較小，結(jié)合核苷酸多樣性和單倍型數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，該品種牛遺傳多樣性豐富.而巴美牛與其他牛種有一定的親緣關(guān)系，人工選擇對其影響較大.

4 結(jié)論

本研究從mtDNA 基因組出發(fā)，對4 個群體mtDNA D-loop 區(qū)進行克隆測序，并初步分析了序列結(jié)構(gòu)，探究了西藏牛亞科部分品種的遺傳多樣性和進化關(guān)系，西藏黃牛具有豐富的遺傳多樣性，不同品種間遺傳關(guān)系復雜.要徹底弄清西藏黃牛的起源演化，需大量收集更多地區(qū)的黃牛品種，擴大研究范圍，進一步深入研究也許才能解決這一問題，使得種質(zhì)資源得到有效保護和利用.