向君亮，唐呈瑞，王佳琦，劉 權(quán)，張興梅，殷奎德

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，遼寧 沈陽 110016；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

土壤鹽堿化嚴(yán)重制約著全球農(nóng)牧業(yè)的發(fā)展，是當(dāng)前亟待解決的問題之一。大慶地處松嫩平原西部，黑龍江省西南部，其鹽堿化土壤主要為蘇打鹽堿化草甸土和沼澤化草甸土。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大慶市共有鹽堿化土地28.7萬hm2，約占全市總土地面積的59.4%，其中耕地2.1萬hm2，約占耕地總面積的20.9%，其余為牧業(yè)和其它用地。近年來，由于油田開發(fā)和其它人為因素的影響，土壤鹽堿化現(xiàn)象呈明顯加重趨勢[1]。苜蓿被稱為“牧草之王”，其不僅蛋白質(zhì)含量高，產(chǎn)量大，耐旱、耐寒、耐鹽堿脅迫能力強(qiáng)，還能夠改善土壤環(huán)境，增加土壤含氮量，保持水土，在生態(tài)治理與恢復(fù)、高效優(yōu)質(zhì)畜牧業(yè)打造以及優(yōu)化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)結(jié)構(gòu)方面具有重要作用。有研究表明，苜蓿能在輕度鹽堿地上種植，但隨著草原以及耕地土壤鹽堿化程度的加劇，可種植苜蓿的土地面積也逐漸減少[2]。

近年來，隨著科技的發(fā)展，鹽堿地的生物改良手段得到進(jìn)一步應(yīng)用。微生物改良鹽堿地的實(shí)踐，主要是利用對植物有促生作用的細(xì)菌在其根際定殖，改善植物根際環(huán)境，從而減輕鹽堿脅迫對植物的生長抑制作用。植物根際促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR)可以通過固氮、溶磷、解鉀、產(chǎn)植物激素(IAA，GA等)、產(chǎn)ACC脫氨酶、產(chǎn)鐵載體以及誘導(dǎo)植物對生物及非生物脅迫的系統(tǒng)抗性來促進(jìn)植物生長[3-4]。大量研究表明，在應(yīng)對非生物脅迫方面，根際有益微生物有增強(qiáng)植物耐受干旱脅迫、鹽堿脅迫、重金屬脅迫、養(yǎng)分虧缺等非生物脅迫能力。趙琦等[5]研究發(fā)現(xiàn)，混合鹽堿脅迫下，接種叢植菌根真菌可以提高紫花苜蓿的存活率、株高、總生物量、可溶性蛋白質(zhì)含量以及脯氨酸含量；張福海等[6]發(fā)現(xiàn)，施用耐鹽堿促生菌劑后，能夠顯著提高鹽堿環(huán)境下枸杞的產(chǎn)量及品質(zhì)，枸杞枝條的生長、葉片葉綠素含量、產(chǎn)量、百粒重及果實(shí)多糖含量均顯著增加；龐學(xué)兵等[7]研究表明，具有ACC脫氨酶活性的菌株能有效緩解鹽堿脅迫對棉苗生長的抑制作用，提高棉苗對鹽堿脅迫的抵抗能力。由于鹽堿地土壤含鹽量和pH值都較高，中性土壤中篩選得到的PGPR在鹽堿環(huán)境中很難存活定殖，所以一些在中性土壤中有很好促生效果的菌肥在鹽堿土中施用很難發(fā)揮促生作用。在大慶市大面積的鹽堿地中，蘊(yùn)藏著巨大的耐鹽堿微生物資源，必將具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究從鹽堿土壤中分離篩選鑒定耐鹽堿菌株，并對其植物促生功能進(jìn)行檢測，為研制和開發(fā)能夠治理鹽堿土壤的生物制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鹽堿土樣品 本試驗(yàn)中的鹽堿土樣品于2017年9月采集于黑龍江省大慶市龍鳳區(qū)未經(jīng)人為破壞的鹽堿地草原，輕度鹽堿土采集于地表無白色堿斑，且植被覆蓋度良好的地塊，其pH值為8.34，含鹽量為0.30%，速效鉀、有效磷、堿解氮分別為398.00、19.20、315.00 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)為33.70 g·kg-1；中度鹽堿土樣采集于地表有少量白色堿斑，且有稀疏植被覆蓋的地塊，其pH值為9.77，總含鹽量為0.85%，速效鉀、有效磷、堿解氮分別為334.00、17.75、59.00 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)為7.50 g·kg-1；重度鹽堿土采集于地表具有大量白色堿斑且無植被覆蓋地塊，其pH值為10.46，總含鹽量為1.43%，速效鉀、有效磷、堿解氮分別為257.00、56.80、56.00 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)為1.72 g·kg-1；非鹽堿土樣于2017年9月采集于黑龍江省八五零農(nóng)場水稻田，其pH值為5.58，含鹽量為0.06%，速效鉀、有效磷、堿解氮分別為114.10、113.20、223.60 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)為31.40 g·kg-1；采樣深度為地面0～20 cm，挑出枯草、草根及石塊，混勻。

1.1.2 培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基參照Poli A等[8]的方法配制；篩選培養(yǎng)基[9]：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入Na2CO3和NaHCO3使其終濃度分別為50、100 mmol·L-1，調(diào)節(jié)pH值至8.5；PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基按照Gupta R等[10]的方法進(jìn)行配制；阿須貝無氮培養(yǎng)基參照李艷星等[11]的方法進(jìn)行配制；King氏培養(yǎng)基參照Glickmann E等[12]的方法進(jìn)行配制；ADF培養(yǎng)基參照劉莎莎[13]的方法進(jìn)行配制；CAS鐵載體檢測培養(yǎng)基參照榮良燕等[14]的方法進(jìn)行配制。

1.1.3 植物種子 本試驗(yàn)使用的苜蓿品種為“敖漢”，種子由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)草業(yè)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 稱取5 g土壤樣品置于裝有25 ml無菌水的三角瓶中，170 r·min-1振蕩10 min，靜置片刻，以此為原液，吸取上清液稀釋10-4倍后涂于篩選培養(yǎng)基上。28℃培養(yǎng)1周后，挑取單菌落劃線培養(yǎng)，傳代至少3次，直至獲得純種,用50%甘油保存菌種，于-40℃冰柜中備用。

1.2.2 菌株的促生功能檢測 分別參照Rani Gupta等[10]、李艷星等[11]、Eric Glickmann等[12]、劉莎莎[13]以及榮良燕等[14]的方法進(jìn)行菌株解磷、固氮、產(chǎn)IAA、產(chǎn)ACC脫氨酶、產(chǎn)鐵載體能力的定性檢測；參照鄭鵬[15]、詹壽發(fā)等[16]的方法對ACC酶活性以及IAA產(chǎn)量進(jìn)行定量檢測。

1.2.3 菌株16S rDNA序列分析 用“細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒”提取菌株的總DNA后，利用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增其16S rDNA。PCR擴(kuò)增體系為：2× Taq mix 25 μL，引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL；反應(yīng)條件：95℃ 5 min；94℃ 1 min-55℃ 1 min-72℃ 2 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，然后利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，純化后PCR產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在NCBI Blast進(jìn)行序列比對，用MEGA 7做系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 種子的處理及幼苗生長 將菌株接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37℃，175 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h后，10 000 g離心15 min，棄上清，沉淀用無菌生理鹽水洗滌3次后重懸，菌懸液稀釋至108CFU·mL-1，將苜蓿種子經(jīng)表面消毒后，按表1的處理方法對種子進(jìn)行處理，CK和B處理組分別為在非鹽堿脅迫下生理鹽水和菌懸液浸種，S和BS處理組為鹽堿脅迫下生理鹽水和菌懸液浸種，培養(yǎng)皿經(jīng)封口膜封口后置于光照培養(yǎng)箱中25℃，12 h/12 h光/暗培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽勢，培養(yǎng)5 d統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率，培養(yǎng)25 d統(tǒng)計(jì)苗株高、根長和鮮重，用葉綠素儀測定幼苗葉片的SPAD值，SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果分析

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

對非鹽堿土、輕度、中度、重度鹽堿土按1∶5制備土壤浸提液后，將土壤浸提液稀釋，涂布于Na2CO3和NaHCO3終濃度分別為50、100 mmol·L-1，pH 8.5的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，各處理中耐鹽堿細(xì)菌的種類和數(shù)量有所不同，如圖1所示。在非鹽堿土中，經(jīng)過多次反復(fù)培養(yǎng)，篩選培養(yǎng)基上未生長細(xì)菌菌落，說明在本試驗(yàn)設(shè)定的鹽堿條件下，非鹽堿土中幾乎沒有可培養(yǎng)的耐鹽堿細(xì)菌。輕度鹽堿土中，培養(yǎng)基上生長出少量不同形態(tài)的菌落，隨著鹽堿土鹽堿程度的加重，培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)與種類均有所增加，證明本篩選方法適用于耐鹽堿細(xì)菌的篩選。通過篩選，共得到43株不同菌落形態(tài)的耐鹽堿細(xì)菌，編號為S01-S43。

表1 苜蓿種子的處理方法

2.2 菌株促生功能鑒定

將分離得到的耐鹽堿細(xì)菌分別接種于阿須貝無氮培養(yǎng)基、PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基、CAS鐵載體檢測培養(yǎng)基、ADF培養(yǎng)基以及King氏培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，對菌株的促生功能進(jìn)行檢測，結(jié)果如表2所示(無促生功能的菌株已剔除)：共有8株細(xì)菌能在阿須貝無氮培養(yǎng)基上生長，具有固氮能力；沒有菌株能在PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明的溶磷圈，故所有菌株均無解磷能力；有6株菌能在CAS鐵載體檢測培養(yǎng)基上產(chǎn)生橘黃色的暈圈，具有產(chǎn)鐵載體的能力；有3株菌能在ADF培養(yǎng)基上生長，具有產(chǎn)ACC脫氨酶的能力；有4株菌的發(fā)酵液上清能與S2比色液反應(yīng)顯粉紅色，故僅有5株菌能產(chǎn)IAA。菌株S11雖然無固氮、解磷、產(chǎn)鐵載體的能力，但其同時具有產(chǎn)ACC脫氨酶和產(chǎn)IAA的能力，且兩種能力均強(qiáng)于其他菌株，而ACC脫氨酶可以降低植株體內(nèi)乙稀含量，提高植物對鹽堿脅迫的抗性，故選擇菌株S11對其ACC脫氨酶活力以及產(chǎn)IAA量進(jìn)行定量分析及后續(xù)試驗(yàn)；通過對菌株ACC脫氨酶的定量檢測，結(jié)果顯示：菌株S11的ACC脫氨酶活性為25.38 nmol·mg-1·h-1；如圖2C所示，菌株S11在King培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔12 h取培養(yǎng)液上清液測定其IAA產(chǎn)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0～36 h IAA產(chǎn)量增速最快，當(dāng)培養(yǎng)到60 h時，IAA產(chǎn)量幾乎穩(wěn)定在24 mg·L-1左右，不再增長，故可以認(rèn)為，菌株S11產(chǎn)IAA最佳培養(yǎng)時間為48～60 h，其IAA產(chǎn)量最大為24 mg·L-1左右。

表2 各菌株所具有的促生功能情況統(tǒng)計(jì)表

注：“+”表示該菌具有此項(xiàng)功能，“+”的數(shù)量多少表示該功能的強(qiáng)弱;“-”表示該菌無此項(xiàng)功能。

Note: “+” indicates that the strain has this function, and the number of “+” indicates the strength of this function; “-” indicates that the strain has no such function.

2.3 細(xì)菌菌種鑒定

對具有較好促生功能的菌株S11的基因組DNA進(jìn)行提取后，利用引物27F與1492R對其16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化后對序列進(jìn)行測序，所得序列長度為1 460 bp。將獲得的序列片段在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast序列比對分析，并挑選與該菌株16S rDNA序列最相似的模式菌株及其它不同種屬的模式菌株，利用臨近法在Mega 7.0軟件上做系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖3所示，菌株S11與模式菌株BacillushorikoshiiDSMZ8719T在同一分支上，遺傳關(guān)系最為接近，其序列相似度為97.94%，其它序列相似度較高的菌株也均為芽孢桿菌屬，所以初步判定S11為Bacillushorikoshii。

2.4 菌株S11對鹽堿脅迫下苜蓿種子發(fā)芽及幼苗生長的影響

2.4.1 菌株S11對發(fā)芽率及發(fā)芽勢的影響 將苜蓿種子在不同條件下進(jìn)行處理后進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，對不同處理?xiàng)l件下的苜蓿種子發(fā)芽勢及發(fā)芽率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖4所示，pH 8.5, 25 mM Na2CO3鹽堿脅迫可以明顯降低苜蓿種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率(P值分別為0.002和0.019)，抑制苜蓿種子發(fā)芽，其發(fā)芽率僅為55.00%；菌懸液浸種接菌后，苜蓿種子的發(fā)芽率明顯上升(P=0.043)，達(dá)到70.00%，而CK組的發(fā)芽率為73.33%，菌株S11幾乎消除了鹽堿脅迫對種子萌發(fā)的抑制作用；與對照相比，在無鹽堿脅迫下菌液處理后種子的發(fā)芽率無顯著差異，表明菌液處理對種子的發(fā)芽率沒有影響，但在鹽堿脅迫下，苜蓿種子發(fā)芽受到抑制，接種菌株S11后能顯著增強(qiáng)苜蓿種子對鹽脅迫環(huán)境的耐受力，提高發(fā)芽率。

注：(A)為非鹽堿土，(B)為輕度鹽堿土，(C)為中度鹽堿土，(D)為重度鹽堿土。Note：(A) Non saline-alkali soil; (B) Mild saline-alkali soil; (C) Moderate saline-alkali soil; (D) Heavy saline-alkali soil.圖1 不同程度鹽堿脅迫下細(xì)菌生長情況Fig.1 Bacteria growth status in different degrees of saline-alkali stress

注：(A)產(chǎn)ACC脫氨酶定性檢測結(jié)果；(B)產(chǎn)IAA定性檢測結(jié)果，其中S2+IAA為陽性對照，S2為比色液，S11為菌株培養(yǎng)液上清液;(C)不同培養(yǎng)時間IAA產(chǎn)量。Note: (A) Production of ACC deaminase; (B) IAA production, S2+IAA is a positive control, S2 is a colorimetric solution, S11 is a culture supernatant of the strain; (C) IAA production at different culture times.圖2 菌株S11促生功能鑒定結(jié)果Fig.2 Growth promoting function identification results of strain S11

2.4.2 菌株S11對幼苗生長的影響 幼苗在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25 d后，測定幼苗的根長、株高、鮮重以及葉綠素含量，結(jié)果如圖5所示，非鹽堿處理下浸種接菌后，幼苗的根長、株高以及葉綠素含量與對照相比無顯著變化，但鮮重顯著增加(P=0.000)；與對照相比，在堿脅迫條件下，苜蓿幼苗的根長、株高、鮮重和葉綠素含量均顯著降低，幼苗的生長受到了抑制；鹽堿脅迫后接種S11，幼苗的根長、鮮重和葉綠素含量較鹽堿脅迫下顯著增加(P值分別為0.002，0.000和0.000)；可見，芽孢桿菌S11可以緩解輕度鹽堿條件對苜蓿幼苗生長的脅迫作用，促進(jìn)幼苗生長。

圖3 菌株S11系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain S11

注：同一指標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。Note: The different letters in the same index mean significant difference atP<0.05, the same below.圖4 不同處理對苜蓿種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢的影響Fig.4 Effects of different treatments on germination rate and germination potential of alfalfa seeds

圖5 不同處理對幼苗生理指標(biāo)的影響Fig.5 Effects of different treatments on physiological indexes of seedlings

3 討 論

植物根際促生菌(PGPR)是一類存在于植物根際周圍，并且能夠通過其自身特有的功能，如固氮、溶磷、解鉀、產(chǎn)植物激素或ACC脫氨酶等直接或間接促進(jìn)植物生長的微生物。從1922年Lipman等報(bào)道了小麥上的PGPR到現(xiàn)在，研究人員已分離出許多具有促生功能的細(xì)菌并制成了微生物菌劑應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中[3]。大多數(shù)PGPR很難適應(yīng)鹽堿環(huán)境，難以存活，所以普通生物菌肥在鹽堿地應(yīng)用起來具有很大難度。本試驗(yàn)從大慶地區(qū)鹽堿草原土壤中分離得到了一株耐鹽堿菌，經(jīng)過促生功能檢測，其具有產(chǎn)植物激素IAA及ACC脫氨酶功能，我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，菌株S11能在0.3～3 mol·L-1Na+濃度，pH 8.0～11.5的環(huán)境下生長，而大慶地區(qū)輕度鹽堿土的pH值在8.5左右[14]，故判斷菌株S11對大慶地區(qū)的鹽堿土具有良好的適應(yīng)能力，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

乙烯是植物體內(nèi)合成的一種重要激素，可以幫助植物種子打破休眠，促進(jìn)植物的成熟與衰老[21]。當(dāng)植物遇到逆境脅迫時，其乙烯的合成量會顯著增加，這就直接導(dǎo)致了植物的衰老。細(xì)菌產(chǎn)生的ACC脫氨酶可以幫助植物分解掉乙烯的合成前體ACC，將其代謝成α-丁酮酸和氨，并將其作為碳氮源利用，供應(yīng)細(xì)菌生長需求，這樣，一方面使其不斷向體外分泌ACC，降低了植物體內(nèi)的ACC含量從而減少乙烯的合成量，減輕了鹽堿脅迫下乙烯對植物的毒害[22]，提高了植物對環(huán)境脅迫的耐受力；另一方面細(xì)菌從ACC的分解產(chǎn)物中獲得生長所必需的碳氮源，使得這個共生關(guān)系良好地被維持著。

吲哚乙酸(IAA)是植物體內(nèi)普遍存在的天然生長素，低濃度的IAA可以促進(jìn)主根伸長，高濃度的IAA能促進(jìn)側(cè)根的形成和根毛的增加，菌株分泌一定量的IAA可以有效地促進(jìn)植物根系新陳代謝，有助于植物吸收土壤中的營養(yǎng)。IAA有多種合成途徑，其最主要的是色氨酸途徑[26]。本試驗(yàn)在含有色氨酸的King培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株，經(jīng)檢測，其能產(chǎn)生IAA，最大產(chǎn)量在24 mg·L-1左右。鹽堿脅迫下，苜蓿幼苗根的生長受到明顯抑制，其根長較正常條件下下降43.90%，而在接種菌株S11后，幼苗根長所受到的抑制作用明顯得到緩解，根長較鹽堿脅迫下增加了34.78%，這可能是因?yàn)榫戤a(chǎn)生了少量的IAA，低濃度的IAA可以促進(jìn)植物根的伸長，從而緩解了鹽堿脅迫對根的抑制作用；在接種菌株后，幼苗株高相對于鹽堿脅迫下變化不顯著，這和前人報(bào)道的IAA對根的影響大于莖的結(jié)果相符合，也側(cè)面驗(yàn)證了菌株產(chǎn)生的IAA緩解了鹽堿脅迫對幼苗生長的抑制作用，增強(qiáng)了苜蓿的耐鹽堿能力。菌株S11對苜蓿的具體促生機(jī)理以及菌株的耐鹽堿機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究從大慶草原鹽堿土壤中分離得到一株具有產(chǎn)植物激素IAA及產(chǎn)ACC脫氨酶功能的菌株，初步鑒定為堀越氏芽孢桿菌(Bacillushorikoshii)；在鹽堿脅迫條件下，接種菌株S11后能顯著增加苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、根長、株高、鮮重以及葉綠素含量，緩解鹽堿脅迫對苜蓿的抑制作用，促進(jìn)苜蓿生長。