龔英菲 曾現(xiàn)歡 趙維俊 左俊濤 朱鐘凱 王湛博 劉 偉 王 昀 楊 勇

(中國藥科大學新藥安全評價研究中心，南京 211198)

生殖毒性試驗的目的是通過動物試驗反映受試物對哺乳動物生殖功能和發(fā)育過程的影響。胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗(即Ⅱ段生殖毒性試驗) 是評價新藥生殖毒性的首選方法之一。妊娠動物自胚胎著床至硬腭閉合給藥，觀察受試物對妊娠動物母體、胚胎和胎仔發(fā)育的影響，包括胚胎胎仔的死亡、生長改變和結(jié)構(gòu)變化等，為母體孕期接觸新藥可能對胎兒造成的影響提供臨床前的試驗依據(jù)[1]。環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide)是一種氮芥類烷化劑，對多種腫瘤具有明顯的抑制作用，對增殖細胞群的各期均有殺傷作用，具有較強的致畸、致癌和致突變作用。研究表明環(huán)磷酰胺可造成精子缺乏、精子畸形、停經(jīng)等生殖系統(tǒng)毒性，妊娠初期給予可致畸胎。但目前生殖毒性研究主要集中于大鼠和小鼠[2-6]，用于兔生殖毒性研究很少。根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局2006 年發(fā)布的《藥物生殖毒性研究技術(shù)指導原則》，兔是胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究中優(yōu)先選用的非嚙齒類動物，但II 段生殖毒性試驗中關(guān)于兔陽性藥物的致畸背景資料較少[7]。因此，選用陽性對照物并確定相關(guān)的致畸作用對新開展此項試驗具有實際指導意義[8]。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

環(huán)磷酰胺(批號P01637) 購自阿達瑪斯貝塔(上海)化學試劑有限公司，白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，臨用前用生理鹽水配制;茜素紅(批號20110315) 購自天津市化學試劑研究所，褐色固體粉末；硫化銨(批號13071020653) 購自南京化學試劑有限公司，白色固體結(jié)晶；氫氧化鉀(批號20131230) 購自上海凌峰化學試劑有限公司，白色固體粉末；丙三醇(批號20140118) 購自江蘇強盛功能化學股份有限公司，無色澄清溶液；乙醇(批號20140821) 購自國藥集團化學試劑有限公司，無色澄清溶液。

1.2 動物

新西蘭兔購自青島康大生物科技有限公司，普通級，動物生產(chǎn)許可證SCXK (魯) 2012-0005，飼養(yǎng)于中國藥科大學新藥安全評價研究中心，普通級動物房，實驗動物使用許可證SCXK (蘇) 2013-0013，溫度21～25 ℃，相對濕度44%～68%，光照12 h; 單只飼養(yǎng)于不銹鋼籠內(nèi)。飼料為北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)的兔生長繁殖飼料，飲用水為CENTRA-R200凈化系統(tǒng)凈化處理的實驗動物飲用水，籠具和托盤每日清潔更換。

1.3 儀器

體式顯微鏡，型號(SZX7)，Olympus；正置生物顯微鏡，型號(BX43)，Olympus； 電子天平，型號(QUINTIX224-1CN，QUINTIX1102-1CN， PRACTUM2102- 1CN)；賽多利斯；游標卡尺，型號(BZ)，成都成量工具集團有限公司。

1.4 方法

1.4.1動物分組與給藥方案：購買4～5月齡的孕兔40只，交配成功日計為 GD0，并按照體質(zhì)量均衡原則隨機分為對照組和環(huán)磷酰胺組。最終納入統(tǒng)計對照組(0.9%氯化鈉注射液，i.v)16只，環(huán)磷酰胺組(30 mg/kg，i.v.)17只。

1.4.2觀察和檢測：試驗期間進行一般臨床癥狀觀察，體質(zhì)量和攝食量的測定。GD28對孕兔進行過量CO2安樂死，剖宮稱取懷孕子宮總質(zhì)量、子宮、胎盤、卵巢及腦質(zhì)量。記錄黃體數(shù)、死胎數(shù)、活胎數(shù)、吸收胎數(shù)、著床腺數(shù)，并計算子宮、卵巢臟體、臟腦系數(shù)。取出胎仔，存活胎仔自腹腔注射戊巴比妥鈉溶液實施安樂死后記錄胎仔性別、胎仔質(zhì)量、頂臀長、尾長及外觀。全部胎仔進行內(nèi)臟和骨骼檢查，其中除心臟、腦、腎臟用4%甲醛溶液固定后檢查，其余內(nèi)臟當即檢查，骨骼標本用95%的乙醇固定和茜素紅染色后檢查。胎仔外觀畸形檢查包括頭部、四肢、軀干、尾部和肛門。胎仔內(nèi)臟畸形檢查包括有無腭裂、腦水腫、腎積水，眼球是否正常，心、肝、脾、肺、腎和子宮等臟器大小和位置是否異常等。胎仔骨骼畸形檢查包括骨化程度、有無胸骨節(jié)缺失、骨化不全、胸骨節(jié)錯位、多肋、少肋、肋骨分叉、肋融合、波狀肋等。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用均值±標準差(x±s)來表示，先進行方差齊性檢驗，如果采用P>0.05再進行t檢驗，如果P<0.05進行秩和檢驗；有吸收胎的孕兔百分率、有死胎的孕兔百分率、妊娠率、窩別外觀(內(nèi)臟、骨骼)畸形率和窩別內(nèi)臟(骨骼)變異率等采用百分率表示，采用Fisher確切概率法進行分析。P<0.05確認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 對一般臨床癥狀觀察、體質(zhì)量和攝食量的影響

一般臨床癥狀觀察未見明顯異常。GD14～16孕兔的體質(zhì)量增長環(huán)磷酰胺組較對照組明顯降低(P<0.05)，給藥后環(huán)磷酰胺組的攝食量較對照組出現(xiàn)一過性的降低(GD11P<0.05)。

2.2 對孕兔生殖功能及胚胎形成的影響

與對照組相比，孕兔終末體質(zhì)量(GD28)、懷孕子宮質(zhì)量、胎盤質(zhì)量、子宮質(zhì)量、卵巢質(zhì)量及其臟體和臟腦系數(shù)均未見明顯差異。

環(huán)磷酰胺組較對照組著床后丟失率提高近一倍。黃體數(shù)、死胎數(shù)、著床腺數(shù)、活胎數(shù)、吸收胎數(shù)、總丟失率無明顯異常。詳見下表1：

表1 環(huán)磷酰胺對孕兔生殖功能及胚胎形成的影響Table 1 The effect of Cyclophosphamide on rabitreproduxtion and embryo-fetal development

2.3 對胎仔外觀的影響

與對照組相比，胎仔總質(zhì)量，均質(zhì)量分別降低9.62%和16.47%；胎仔身長、尾長分別減少8.00%和17.55%(P<0.05)；腭裂畸形率(32.95%)明顯高于對照組，與對照組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且窩別的腭裂畸形率為73.33%，與對照組比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。詳見下表2：

表2 環(huán)磷酰胺對胎仔外觀的影響Table 2 The effect of Cyclophosphamide onappearance of fetal rabits

注：*表示與對照組比P<0.05

Note：*Compared with the control groupP<0.05

2.4 對胎仔內(nèi)臟的影響

環(huán)磷酰胺組：胎仔的窩別內(nèi)臟變異率為80.00%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，主要變異類型為左心室偏大；胎仔的窩別內(nèi)臟畸形率為73.33%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，主要畸變類型為腎皮質(zhì)髓質(zhì)分界不清。詳見下表3：

表3 環(huán)磷酰胺對胎仔內(nèi)臟檢查指標的影響Table 3 The effect of Cyclophosphamide on fetal organs

注：*表示與對照組比P<0.05

Note：*Compared with the control groupP<0.05

2.5 對胎仔骨骼的影響

環(huán)磷酰胺組：除胸椎、肋骨骨化數(shù)與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)外，枕骨骨化程度、其他骨化數(shù)及胎仔窩別骨骼變異率差異均無統(tǒng)計學意義。胎仔骨骼畸變率為86.67%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見下表4：

表4 環(huán)磷酰胺對胎仔骨骼檢查指標的影響Table 4 The effect of Cyclophosphamide on fetal skeleton

注：*表示與對照組比P<0.05

Note：*Compared with the control groupP<0.05

3 討論

本研究中，以環(huán)磷酰胺作為陽性藥物，采用靜脈注射途徑、給藥劑量30 mg/kg、給藥時間GD11，觀察環(huán)磷酰胺對新西蘭兔胎仔畸形的影響以確定此方法可行程度。

環(huán)磷酰胺作為廣譜的抗癌藥物，藥物的不良反應(yīng)也較突出，特別是在生殖方面。環(huán)磷酰胺能透過血胎屏障和血乳屏障，所以臨床上妊娠婦女禁用，哺乳期婦女用藥時必須停止哺乳。

不同給藥途徑的相對吸收率不同，一般依次為靜脈注射>經(jīng)口給藥>皮下注射[9]。有報道給兔GD6～20連續(xù)灌胃給予環(huán)磷酰胺18 mg/kg畸形比例適當，胎仔生長發(fā)育也受到明顯的影響[10]。皮下注射環(huán)磷酰胺畸形比例較高，胎仔的體格和生長發(fā)育會受到明顯影響，吸收胎數(shù)量較多，導致可供進行檢查的胎仔數(shù)量略少[8]，但本研究前期預實驗中，新西蘭兔GD6～20進行連續(xù)經(jīng)口灌胃給予環(huán)磷酰胺18 mg/kg·d-1會導致孕兔出現(xiàn)流產(chǎn)，亦會導致檢查的胎仔數(shù)量減少。所以正式試驗的過程中選擇靜脈注射，耳緣靜脈注射給藥操作較為簡單且對動物造成的應(yīng)激性較小，靜脈注射吸收率高從而使用環(huán)磷酰胺較少。

本研究中發(fā)現(xiàn)給藥后環(huán)磷酰胺組較對照組體質(zhì)量和攝食量有一定的降低，說明本試驗采用的30 mg/kg環(huán)磷酰胺在試驗過程中對孕兔產(chǎn)生了一定的毒副作用，為一過性的。如果劑量加大或者是給藥頻次增加，可能會導致毒性太大，對胎仔產(chǎn)生不可逆的影響，致使胎仔出現(xiàn)死亡或者流產(chǎn)，會導致樣本缺失，無法分析。從胎仔的外觀上來看，環(huán)磷酰胺組和對照組窩胎仔總數(shù)沒有明顯差異，但環(huán)磷酰胺組胎仔的均質(zhì)量、身長、尾長均低于對照組，四肢的畸變率明顯高于對照組。對胎仔內(nèi)臟進行檢查，環(huán)磷酰胺組的變異率和畸形率明顯高于對照組。對胎仔的骨骼進行檢查，環(huán)磷酰胺組骨骼的畸變種類和數(shù)目都明顯高于對照組。有報道雌性大鼠GD7～11 靜脈注射環(huán)磷酰胺5 mg/kg·d-1，GD20剖取胎仔，發(fā)現(xiàn)對中軸骨骼畸形的誘導具有階段和部位特異性。本研究采取的GD11亦處于中軸骨骼發(fā)生畸形的敏感期[11]。本研究中環(huán)磷酰胺GD11 給藥組骨骼畸形的比例為86.67%，基本全部集中于中軸骨骼。環(huán)磷酰胺作用機理體內(nèi)被肝臟或腫瘤內(nèi)存在的過量磷酰胺酶或磷酸酶水解變成活化的磷酰胺氮芥與DNA發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，抑制DNA的合成，特別是G2期(DNA合成后期)，干擾RNA的功能，從而導致胎仔發(fā)育遲緩，外觀、內(nèi)臟、骨骼的畸變。環(huán)磷酰胺還會使T細胞和B細胞的絕對數(shù)目減少，從而影響免疫系統(tǒng)的發(fā)育[12]。綜上所述可知我們采用30 mg/kg環(huán)磷酰胺在GD11給予孕兔，對胎仔產(chǎn)生的畸變種類較為合適。選用環(huán)磷酰胺作為生殖毒性試驗的陽性對照是合適的。

在本實驗條件下。30 mg/kg環(huán)磷酰胺對孕兔生殖功能及胚胎形成無明顯影響，但可顯著影響胎仔發(fā)育，可引起胎仔外觀畸形、內(nèi)臟變異、內(nèi)臟畸變和骨骼畸變。本次實驗方法可靠。