曲秀龍 , 王 利 , 李 璟

(1．西南民族大學(xué)青藏高原研究院 ， 四川 成都 610041 ； 2．西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 ，四川 成都 610041 ； 3.成都理工大學(xué)環(huán)境學(xué)院 ， 四川 成都 610059)

庫拉索蘆薈(Aloebarbadensis)含有豐富的蘆薈多糖、蒽酮類物質(zhì)、生物活性酶等多種活性成分，具有美容、抗輻射、抗腫瘤、保護(hù)胃黏膜及肝臟的功效[1-2]，一定量的庫拉索蘆薈提取物的抑菌消炎功能與抗生素相當(dāng)，并且低毒環(huán)保不會使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性[3-4]。庫拉索蘆薈兼具藥用與食用價值，是我國唯一可用于食品生產(chǎn)加工的蘆薈品種。且易于種植，來源廣泛，可作為飼料改善雞、豬、牛等養(yǎng)殖動物的生產(chǎn)性能，具有很強的經(jīng)濟(jì)效益[5]。

嗜水氣單胞菌(AeromonasHydrophila)是弧菌科氣單胞菌屬的條件致病菌，其致病菌株的致病動物群體廣泛[6]。對于淡水養(yǎng)殖業(yè)，嗜水氣單胞菌引起的細(xì)菌性敗血癥危害范圍大，流行季節(jié)長，是魚源致病氣單胞菌中造成經(jīng)濟(jì)損失最大的病菌[7]。維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)是另一種常見的致病弧菌科氣單胞菌，易引起魚類的敗血癥和魚體潰瘍綜合征。隨著漁業(yè)的發(fā)展，抗生素被大量使用，氣單胞菌的耐藥性也日趨嚴(yán)重[8]。為緩解氣單胞菌的耐藥性，開發(fā)中藥提取物作為抗生素的替代品刻不容緩。

本次試驗檢測了庫拉索蘆薈對嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小滅菌濃度(MBC)，并比較庫拉索蘆薈與各種抗生素對維氏氣單胞菌的抑菌效果，通過分析庫拉索蘆薈治療嗜水氣單胞菌攻毒鯽魚的數(shù)據(jù)，本次試驗對開發(fā)抗生素替代品治療氣單胞菌的感染進(jìn)行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 1年齡庫拉索蘆薈購自成都花卉市場，經(jīng)專家鑒定為庫拉索蘆薈；供試嗜水氣單胞菌(菌株編號：AeH0627)、維氏氣單胞菌(菌株編號：AeV0624)分離自體重120 g的患病鯽魚肝臟，由西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實驗室保存和提供；鯽魚，購自成都海鮮市場。M-H培養(yǎng)基和L-B培養(yǎng)基，購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。使用儀器有超聲波破碎儀，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，離心機，電熱恒溫培養(yǎng)箱等。

1.2 方法

1.2.1 庫拉索蘆薈的提取 剪取新鮮庫拉索蘆薈全葉，使用0.4%的KMnO4溶液和75%的乙醇依次消毒之后瀝干，置于烘箱55 ℃干燥過夜。稱取干燥蘆薈100 g，于1 000 mL 75%乙醇溶液中浸泡2 h，再超聲波破碎細(xì)胞75 min，真空抽濾之后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀使提取物濃縮至黑色膏狀；重復(fù)上述步驟并混合2次提取物，加入無菌蒸餾水使提取物稀釋至15 mL，0.45 μm過濾器過濾后紫外光下滅菌15 min，得到庫拉索蘆薈提取物。

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定 按二倍稀釋法，在無菌96孔深孔板中加入100 μl LB液體培養(yǎng)基、100 μL不同濃度的庫拉索蘆薈提取物和10 μL濃度為1×108CFU/mL菌液，于37 ℃ 180 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h，所得的澄清組對應(yīng)的最低濃度接近MIC；縮小蘆薈提取物的濃度梯度，重復(fù)上述試驗。所得溶液均通過鏡檢排除雜質(zhì)的干擾，澄清組中最低濃度即最小抑菌濃度。

1.2.3 最小滅菌濃度(MBC)的測定 使用二倍稀釋法，將最小抑菌濃度的澄清組溶液分別取出10 μL 接種到M-H瓊脂平板上，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，所得無細(xì)菌生長組對應(yīng)的最低濃度即最小滅菌濃度。

1.2.4 藥敏試驗(AST) 使用紙片擴散法，取多片直徑0.60 cm的無菌圓濾紙片，放入最小滅菌濃度的蘆薈提取物中充分浸泡24 h后紫外光下滅菌干燥。采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄅ鋫錆舛?×108CFU/mL菌懸液，取出10 μL涂在LB平板上，再取濾紙片貼在含菌平板上，每個平板隨機貼3片，以抗生素藥敏紙片作為陽性對照，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后測量其抑菌圈直徑。

1.2.5 攻毒與治療試驗 45尾健康鯽魚飼喂3 d后，隨機分為對照組、感染組和治療組，其中感染組與治療組每尾魚均腹腔注射20 μL濃度為1×108CFU/mL的嗜水氣單胞菌菌液，放入不同玻璃缸(長×寬×高：80 cm×50 cm×25 cm)中喂養(yǎng)。對照組及感染組不給藥，治療組經(jīng)口灌服10 mL濃度為133 mg/mL的蘆薈提取物，治療5 d。第1次灌服在注射細(xì)菌后12 h，之后每12 h觀察記錄各組魚的生理狀況變化并統(tǒng)計死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 MIC和MBC的測定 根據(jù)計算方法：X(MIC.MBC)=提取物mg/(提取物mL+液體營養(yǎng)液mL+菌液mL)，得到庫拉索蘆薈提取物對嗜水氣單胞菌平均MIC為95 mg/mL、MBC為105 mg/mL；對維氏氣單胞菌平均MIC為61 mg/mL、MBC為65 mg/mL，結(jié)果見表1。

表1 庫拉索蘆薈對嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌的MIC及MBC

2.2 藥敏試驗 藥敏試驗顯示，庫拉索蘆薈提取物對嗜水氣單胞菌的抑菌圈平均為10 mm，對維氏氣單胞菌抑菌圈平均為16 mm。通過與抗生素藥敏試驗結(jié)果進(jìn)行對比顯示，蘆薈提取物對維氏氣單胞菌的抑菌效力與強力霉素、頭孢曲松、紅霉素、諾氟沙星和奧復(fù)星等近似。結(jié)果見表2、表3。

表2 嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌的藥敏結(jié)果

表3 抗生素對維氏氣單胞菌藥敏結(jié)果

2.3 攻毒與治療試驗 鯽魚在注射嗜水氣單胞菌菌株AH1 10 h后，感染組與治療組中部分魚的眼睛和鰓蓋邊緣輕微充血。24 h后感染組部分魚腹鰭充血，并開始出現(xiàn)死亡。隨著治療組繼續(xù)給藥治療，治療組魚的癥狀減輕。60 h時，對照組出現(xiàn)1尾魚死亡，但無明顯嗜水氣單胞菌感染癥狀。72 h后感染組全部死亡，治療組基本恢復(fù)正常生理狀況。結(jié)果見表4。

表4 嗜水氣單胞菌AH1對鯽魚攻毒試驗結(jié)果

3 討論

近些年，庫拉索蘆薈作為具有高食用和藥用價值的經(jīng)濟(jì)作物備受養(yǎng)殖、制藥和化妝品等行業(yè)關(guān)注。目前對蘆薈提取物的抑菌作用研究顯示，蘆薈葉提取物的抑菌作用隨濃度的增加和抑菌時間的延長而增強，熱處理不會影響其抑菌效果。不同種類蘆薈的提取物對同一種菌的抑菌效果不同，庫拉索蘆薈提取物對原核生物中的金黃色葡萄球菌抑菌作用較強，對枯草芽孢桿的抑菌作用較弱；對真核生物中的黑曲霉抑菌作用較強、對酵母菌的抑菌作用較弱[9]。不同提取物的濃度也是影響抑菌效果的主要因素，蘆薈提取物的成分較復(fù)雜不易量化，建議實驗前做單一成分的測試并調(diào)整提取物用量，或可使用電化學(xué)法測試庫拉索蘆薈濃度，檢出限在2 μg左右[10-11]。

嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的兩種條件性致病菌，抗生素的大量使用造成氣單胞菌的耐藥性成倍提升[12]。對鱉源嗜水氣單胞菌的耐藥性研究顯示，嗜水氣單胞菌的耐藥性與不同地區(qū)的用藥習(xí)慣有關(guān)，治療前最好先做藥敏測試[13]。庫拉索蘆薈對嗜水氣單胞菌的MBC為105 mg/mL。這和艾葉、穿心蓮、虎杖片對嗜水氣單胞菌的MBC相近[14]。白術(shù)多糖、沒食子酸等中藥提取物可以有效抑制嗜水氣單胞菌，但受pH值影響較嚴(yán)重，還未發(fā)展出成熟的技術(shù)可以應(yīng)用于生產(chǎn)[15]。庫拉索蘆薈提取物對維氏氣單胞菌有良好的抑菌作用，但未見與抗生素的抑菌效果進(jìn)行比較[16]。本次試驗測得庫拉索蘆薈對維氏氣單胞菌的抑菌圈直徑與五倍子相近。在庫拉索蘆薈治療嗜水氣單胞菌的攻毒試驗中，治療組的死亡率降低至20%，與其他防治措施相比，可以達(dá)到較好的治療效果。通過蜂膠與庫拉索蘆薈混合物對嗜水氣單胞菌攻毒尼羅羅非魚的治療結(jié)果可以看出，尼羅羅非魚的存活率上升，血液參數(shù)也有顯著提高[17]。鯽魚的養(yǎng)殖密度大，鱗片受傷后更易被致病菌感染。蘆薈中的多種活性成分也可以促進(jìn)鯽魚受傷組織處肉芽形成，加快傷口愈合，減少鯽魚被致病菌感染的幾率。庫拉索蘆薈皮渣是蘆薈凝膠加工產(chǎn)生的廢棄物，占蘆薈鮮葉重量的50%，含有豐富的多糖和蒽醌類化合物卻被大量丟棄，或可添加在養(yǎng)殖飼料中，增加飼料蛋白含量的同時增強魚類免疫[18-21]。

4 結(jié)論

綜合分析表明，庫拉索蘆薈與各抗生素對維氏氣單胞菌的比對結(jié)果較好，庫拉索蘆薈提取物對維氏氣單胞菌的抑菌效力與強力霉素、紅霉素、奧復(fù)星等相當(dāng)。

綜上所述，庫拉索蘆薈提取物對嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌有較好的抑菌作用，可以用于治療氣單胞菌的感染。庫拉索蘆薈廢渣也可能開發(fā)用作飼料，增加魚類飼料蛋白含量，增強魚類免疫，同時減少腸道病菌的感染。