陳 靜，張 娜,張培訓(xùn)，李雅男，郭 莉

(1.保定冀中藥業(yè)有限公司，河北保定 071000； 2.河北省中獸藥工程技術(shù)研究中心,河北保定 071500)

雙黃連口服液臨床用藥廣泛，是目前抗病毒、治療呼吸道感染性疾病的首選藥之一。《中華人民共和國獸藥典》2015版采用2種流動相分別檢測黃芩苷、綠原酸、連翹苷的含量，過程復(fù)雜、耗時較長[1]。賀國彬等[2-4]建立了HPLC同時檢測雙黃連制劑中多種成分的方法，大大縮短了更換流動相需要的配制及平衡時間，但是由于HPLC系統(tǒng)自身的特點(diǎn)，單針樣品的分析周期仍在60 min以上。近年來，顧媛媛[5-7]等人采用UPLC-MS或UPLC-MS-MS的方法對雙黃連制劑中3種或多種有效成分進(jìn)行了含量測定方法的摸索，極大提高了靈敏度和工作效率，可由于質(zhì)譜儀高昂的價格及檢測費(fèi)用使這些方法僅停留在研究階段，難以推廣應(yīng)用。本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，建立了UPLC-TUV同時測定雙黃連口服液黃芩苷、綠原酸、連翹苷的含量的分析方法，該方法準(zhǔn)確、快速、靈敏度高，為雙黃連口服液多成分的快速分析奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試藥 Acquity UPLC H-Class 超高效液相系統(tǒng)，Acquity UPLC TUV紫外檢測器，BEH C18色譜柱 (2.1 mm×100 mm,1.7 μm )，Masslynx色譜工作站(美國Waters公司)、CPA225D電子分析天平(德國Sartorius公司)。黃芩苷對照品(批號：Z0271705，純度為96.8%)，綠原酸對照品(批號：Z0261702)，連翹苷對照品(批號：110821-201615，純度為94.9%)均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。雙黃連口服液(保定冀中藥業(yè)有限公司，規(guī)格：100 mL/瓶，批號：201810008)，乙腈(Merck公司，色譜純)，甲酸(Fisher Scientific，色譜純，批號：106055A)

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈(A)-0.1%甲酸(B)梯度洗脫(0～0.3 min，5%～10%A；0.3～2.0 min，10%～10%A；2.0～4.0 min，10%～13%A；4.0～4.01 min，13%～15%A；4.01～9.0 min，15%～15%A；9.0～12.0 min，15%～20%A；12.0～15.0 min，20%～25%A；15.0～20.0 min，25%～80%A；20.0～20.01 min，80%～5%A；)；檢測波長為278 nm，流速：0.3 mL/min，柱溫：25 ℃。

1.2.2 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品、綠原酸對照品、連翹苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含黃芩苷150 μg、綠原酸9 μg、連翹苷6.0 μg的儲備液。再分別精密量取各個對照品儲備液，加30%甲醇制成每1 mL含黃芩苷5 μg、綠原酸0.3 μg、連翹苷0.2 μg的混合對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 精密量取雙黃連口服液1 mL，置50 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，再精密量取1 mL加50%甲醇稀釋至10 mL，搖勻，再精密量取1 mL加30%甲醇稀釋至8 mL，搖勻，過濾，即得。

1.2.4 陰性雙黃連口服液的制備 參照《中華人民共和國獸藥典》2015版二部分別制備缺黃芩、缺金銀花和缺連翹的陰性雙黃連口服液。

2 結(jié)果和分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性 通過對比雙黃連口服液樣品和自行制備的各個陰性樣品，記錄色譜圖，結(jié)果表明在與黃芩苷對照品(保留時間13.15 min)、綠原酸對照品(保留時間2.45 min)、連翹苷對照品(保留時間14.05 min)保留時間一致處，雙黃連口服液中均見相對應(yīng)的色譜峰。同時各陰性樣品在與3種對照品保留時間一致處無干擾(圖1)，因此，該方法的專屬性良好。

圖1 混合對照品超高效液相色譜圖Fig 1 UPLC chromatograms of mixed standards

圖2 雙黃連口服液超高效液相色譜圖Fig 2 UPLC chromatograms of Shuanghuanglian Oral Liquid

1：缺連翹陰性； 2：缺金銀花陰性； 3:缺黃芩陰性圖3 缺味陰性樣品超高效液相色譜圖Fig 3 UPLC chromatograms of negative samples

2.1.2 線性 精密量取1.2.2項(xiàng)下的各對照品的儲備液各1 mL，加30%甲醇定容至10 mL，即得到黃芩苷、綠原酸、連翹苷濃度分別為15、0.9、0.6 μg/mL的混合對照品溶液母液。精密量取上述溶液0.5、1、2、3 mL置5 mL量瓶中，加30%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得黃芩苷濃度為1.5、3、6、9、15 μg/mL，綠原酸濃度為0.09、0.18、0.36、0.54、0.9 μg/mL，連翹苷濃度為0.06、0.12、0.24、0.36、0.6 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。照1.2.1液相條件測定，并計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見表1。

表1 3種對照品的線性關(guān)系考察Tab 1 Liner range,regression equation and limit of 3 standards

2.1.3 精密度 取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次測定。經(jīng)計算黃芩苷、綠原酸、連翹苷的峰面積RSD分別為0.16%、0.15%、0.06%，表明該方法精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性 按1.2.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，測得該批產(chǎn)品中黃芩苷、綠原酸、連翹苷的平均含量分別為15、0.9、0.7 mg/mL，RSD分別為0.62%、0.28%、0.69%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性 取2.4項(xiàng)下的同一份供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣測定，測得黃芩苷、綠原酸、連翹苷峰面積的RSD分別為0.52%、0.65%、0.96%，結(jié)果顯示黃芩苷、綠原酸、連翹苷在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 準(zhǔn)確度 精密量取已知含量的雙黃連口服液樣品，分別按約80%，100%，120%比例加入3種質(zhì)量濃度的對照品溶液，按1.2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件，分別注入色譜儀測定，每個濃度各分別制備3份供試品溶液進(jìn)行測定，計算回收率和RSD，結(jié)果見表2。3種物質(zhì)的加樣回收率均在97%～103%之間，RSD均小于2.5%。

表2 雙黃連口服液3種成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab 2 Recovery results of 3 compands in Shuanghuanglian Oral Liquid(n=9)

2.2 含量測定 取3批雙黃連口服液樣品，按照上述所建立的色譜方法采用外標(biāo)法測定。同時與采用《中華人民共和國獸藥典》2015版二部收載的含量測定方法比較，結(jié)果顯示2種方法測定結(jié)果基本一致，相對偏差均小于2%，見表3。

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測波長的選擇 據(jù)文獻(xiàn)報道，結(jié)合紫外可見全波段掃描發(fā)現(xiàn)，黃芩苷和綠原酸的最大吸收波長分別為 278 nm[8]和327 nm[9]，連翹苷的最大吸收波長為228 nm和277 nm[10]，樣品中連翹苷含量較低，且在278 nm處黃芩苷和綠原酸有較好的紫外吸收。因此，選擇278 nm吸收波長作為檢測波長，既滿足了3種成分的檢測靈敏度需要，又達(dá)到了簡化檢測方法的目的。

表3 2種方法含量測定結(jié)果比較Tab 3 Determinnstion results of comparision of the two methods

3.2 流動相的選擇 對比甲醇-0.1%甲酸和乙腈-0.1%甲酸流動相的分離效果，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸為流動相時綠原酸峰的拖尾得到明顯改善，同時黃芩苷的峰形較理想，并通過優(yōu)化梯度洗脫的程序使各目標(biāo)峰的分離度、峰形均符合要求。

3.3 進(jìn)樣溶液的選擇 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，進(jìn)樣溶液的甲醇濃度對綠原酸色譜峰的峰形影響顯著，以30%甲醇為進(jìn)樣溶液時峰形尖銳、對稱，分離度良好。最終確定30%甲醇作為進(jìn)樣溶液。

3.4 供試品溶液穩(wěn)定性考察 我們在進(jìn)行供試品溶液穩(wěn)定性考察時發(fā)現(xiàn)：黃芩苷的含量在24 h開始降低，同時在保留時間18 min處，有一新物質(zhì)峰生成，且該新物質(zhì)峰隨著黃芩苷含量的降低峰面積逐漸增大，因此該供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 結(jié)論 本方法建立了UPLC-TUV法檢測雙黃連口服液中3種有效成分的方法，前處理簡單，快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于雙黃連口服液的質(zhì)量控制，為快速有效地控制雙黃連口服液提供新的方法。