趙 虎，樊曉培，羅力力，張 瑞，蒼 晶，徐慶華，于 晶，張 達

(東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030)

低溫限制著全世界農(nóng)作物的分布及產(chǎn)量。植物對低溫的應答是一個涉及多基因、多信號途徑的復雜過程，植物激素脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)等參與這個過程，并發(fā)揮重要作用[1]。JA及其衍生物茉莉酸甲酯(MeJA)是主要的茉莉酸類物質(zhì)，可作為信號分子，參與植物響應生物及非生物脅迫。

有研究表明，外施MeJA可以顯著提高低溫脅迫下小麥幼苗超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶的活性，增加可溶性蛋白的含量，降低相對電導率和丙二醛(MDA)含量，從而維持細胞膜的完整性，增強小麥抵抗低溫的能力[2]。低溫脅迫增加了小麥[3]、水稻[4]和擬南芥[5]體內(nèi)JA的水平，促進了擬南芥、水稻JA生物合成基因的表達[4-5]，抑制了水稻JA分解代謝相關酶基因的表達[4]。JA信號途徑包括信號產(chǎn)生、轉導及下游基因表達[6]，COI1/JAZ/MYC2是JA信號轉導的核心模塊。COI1(Coronatine insensitive 1，冠菌素不敏感因子1)是JA信號轉導途徑的受體。JAZ蛋白(Jasmonate ZIM-domain，茉莉酸ZIM結構域)是轉錄抑制因子，可與MYC2結合抑制JA早期響應基因的表達。MYC2(Myelocytomatosis protein 2，髓細胞組織增生蛋白2)是JA信號途徑的轉錄激活因子，在其信號轉導中起重要作用[7-8]。 PDF1.2(Plant defensin 1.2，植物防衛(wèi)素)基因編碼一種植物防衛(wèi)蛋白，研究JA不敏感型和缺陷型突變體發(fā)現(xiàn)，擬南芥中AtPDF1.2、AtVSP2(Vegetative storage proteins 2)基因的表達受JAs的誘導及JA信號轉導途徑的調(diào)控。

東農(nóng)冬麥1號是首例能在東北寒冷地區(qū)安全越冬的小麥栽培品種，可耐受-30 ℃低溫，返青率高于85%，其強抗寒性得到公認。本課題組前期用東農(nóng)冬麥1號分蘗節(jié)構建了三個低溫脅迫(5 ℃、-10 ℃和-25 ℃)相關的miRNA庫[9]，應用生物信息學軟件對其靶基因進行了GO富集分析和KEGG通路分析[10-11]，發(fā)現(xiàn)植物激素信號轉導途徑中 JA代謝的關鍵基因發(fā)生了表達變化。然而，JA是否調(diào)控冬小麥低溫脅迫下的抗寒響應以及JA信號轉導途徑中的COI1、MYC2在冬小麥抗寒應答中所起的作用尚不明確，故本研究以東農(nóng)冬麥1號為材料，探討外源MeJA處理、大田自然降溫條件下，冬小麥越冬期在低溫脅迫下抗寒生理的變化，并在最佳濃度處理下，研究TaPDF1.2、TaCOI1、TaMYC2基因表達量的變化，以期為揭示JA信號途徑關鍵基因在冬小麥響應抗寒中的作用機制、激素JA調(diào)控冬小麥抗寒分子機制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試材料為冬小麥(TriticumaestivumL.)品種東農(nóng)冬麥1號，由東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院小麥室提供。試驗于2016-2017年在東北農(nóng)業(yè)大學校內(nèi)試驗田進行。2016年9月13日播種，完全區(qū)組設計，小區(qū)面積5 m2(2.5 m×2 m)，每個小區(qū)種植12行，行距15 cm。每行播種150粒，播深4～5 cm，常規(guī)管理。在小麥三葉期(2016年10月1日)分別對葉片噴施濃度為0.5、1.0和2.0 mmol·L-1的MeJA和蒸餾水(含0.02%的酒精)。大田自然降溫且最低氣溫連續(xù)10日為5 ℃(2016年10月8日)、0 ℃(2016年10月25日)、-10 ℃(2016年11月9日)、-25 ℃(2017年1月11日)時分別取葉片及分蘗節(jié)(地下部分主根以上約1～2 cm左右的白色分蘗密集部位，并避免留取綠色部位)，迅速洗凈吸干，剪成1 cm左右大小并分別裝袋，用液氮迅速冷凍后，置于-80 ℃的超低溫冷凍儲存箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 生理指標的測定[12]

低溫傷害程度的測定采用外滲電導法，丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸法，脯氨酸含量測定采用茚三酮顯色法，可溶性糖含量測定采用蒽酮法，可溶性蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍G-250法，SOD活性測定采用NBT法，POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，CAT活性測定采用紫外吸收法。設置3次生物學重復。

1.3 基因表達分析

基因表達分析采用RT-qPCR 法。根據(jù)已得到的TaPDF1.2、TaCOI1和TaMYC2基因(GenBank登錄號分別為NM_123809.4、HM447645.1 和KM382421.1)序列設計實時定量PCR引物，TaPDF1.2基因的正向引物和反向引物分別為5′-CCTTATCTTCGCTGCTCTTGTTC-3′和5′-CT TCTGTGCTTCCACCATTGC-3′，TaCOI1基因的正向引物和反向引物分別為5′-TTGCGGT GAGGAATGTGATTG-3′和5′-TACGGCTAT GGCTGTTAGGC-3′。TaMYC2基因的正向引物和反向引物分別為5′-GATACCCGGGGAACTTG AGCTAG-3′和5′-TCTTCCCGCCGACTTCAT GA-3′。

依次進行總RNA的提取(Trizol法)及基因組DNA的去除、反轉錄，并以反轉錄形成的cDNA為模板進行RT-qPCR檢測。在Mx-3000p Real-Time PCR System(Stratagene，美國)上按照SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa，日本)說明書進行RT-qPCR。以小麥TaActin為內(nèi)參基因，其擴增引物序列為5′-CCTTAGTACCTTCCAACAGATGT-3′和5′-CCAGACAACTCGCAACTTAGA-3′。采取2-△△Ct法計算待測基因的相對表達量。

1.4 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Microsoft Office 2016 Excel作圖，用SPSS 22軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 MeJA對低溫脅迫下東農(nóng)冬麥1號抗寒生理的影響

2.1.1 對低溫傷害程度的影響

由表1可知，隨著溫度的降低，處理組與對照組冬小麥葉片和分蘗節(jié)的相對電導率均逐漸增大，-25 ℃達到最大值。分蘗節(jié)的相對電導率均小于葉片，表明分蘗節(jié)的受傷害程度小于葉片，這與分蘗節(jié)作為冬小麥主要的越冬器官有關。

5 ℃下，葉片中MeJA各濃度處理組與對照組的相對電導率差異均不顯著，可能是因為MeJA在該溫度下尚未發(fā)揮作用；0 ℃、-10 ℃和-25 ℃下，與對照相比，1.0 mmol·L-1的MeJA處理均顯著降低了葉片的相對電導率，而0.5和2.0 mmol·L-1MeJA處理的效果在有些溫度下不明顯。5 ℃和0 ℃下，分蘗節(jié)中MeJA各濃度處理組與對照組的相對電導率差異均不顯著，可能是因為MeJA在這兩個溫度下尚未發(fā)揮作用；-10 ℃和-25 ℃下，與對照相比，1.0 mmol·L-1的MeJA處理均顯著降低了分蘗節(jié)中的相對電導率，0.5和2.0 mmol·L-1MeJA處理的效果在有些溫度下不明顯。說明1.0 mmol·L-1的MeJA處理可以提高小麥的抗寒性。

2.1.2 對丙二醛(MDA)含量的影響

由表1可知，隨著溫度的降低，處理組與對照組冬小麥葉片中MDA含量均呈先下降后上升的趨勢，而分蘗節(jié)中MDA的含量均呈逐漸增加的趨勢，-25 ℃均達到最大值。分蘗節(jié)的MDA含量低于葉片，表明分蘗節(jié)的膜脂過氧化程度小于葉片、抗寒性強于葉片。

5 ℃下，葉片中0.5和1.0 mmol·L-1MeJA處理組與對照組的MDA含量差異不顯著，2.0 mmol·L-1MeJA處理的MDA含量顯著高于對照，分蘗節(jié)中MeJA各濃度處理組與對照組的MDA含量差異均不顯著，說明該溫度尚未構成對東農(nóng)冬麥1號的脅迫，尚未引起JA信號分子對低溫脅迫的響應，此時，高濃度的MeJA處理對小麥葉片反倒有傷害。0 ℃、-10 ℃和-25 ℃下，與對照相比，0.5和1.0 mmol·L-1MeJA處理顯著降低了葉片中的MDA含量，1.0和2.0 mmol·L-1MeJA處理顯著降低了分蘗節(jié)中的MDA含量。表明1.0 mmol·L-1外源MeJA處理可以提高冬小麥的抗寒性。

2.1.3 對脯氨酸含量的影響

從表1可知，隨著溫度的降低，處理組與對照組冬小麥葉片及分蘗節(jié)中脯氨酸的含量均呈先升高后降低的趨勢，-10 ℃達到最大值。分蘗節(jié)的脯氨酸含量大于葉片。與對照組相比，1.0 mmol·L-1MeJA處理均顯著提高了小麥葉片及分蘗節(jié)的脯氨酸含量，0.5和2.0 mmol·L-1MeJA處理的效果在有些溫度下不明顯。說明濃度適宜的外源MeJA可能會通過提高脯氨酸的含量來增加細胞的保水力，從而提高其抗寒性。

2.1.4 對可溶性蛋白及可溶性糖含量的影響

從表1可知，隨著溫度的降低，處理組與對照組葉片及分蘗節(jié)中可溶性蛋白及可溶性糖含量均呈先增加后降低的趨勢，最大值均出現(xiàn)在-10 ℃。分蘗節(jié)的可溶性蛋白及可溶性糖含量均高于葉片。與對照組相比，1.0 mmol·L-1的MeJA處理均顯著提高了冬小麥葉片和分蘗節(jié)中可溶性蛋白及可溶性糖的含量，而0.5和2.0 mmol·L-1MeJA處理的效果在有些溫度下不明顯。說明濃度適宜的外源MeJA可以通過提高可溶性蛋白及可溶性糖的積累來提高小麥的滲透調(diào)節(jié)能力，從而提高其抗寒性。

表1 MeJA對低溫脅迫下東農(nóng)冬麥1號抗寒生理的影響Table 1 Effect of MeJA on cold resistance physiology of Dongnong Dongmai 1 under low temperature stress

同一溫度、同一指標的數(shù)據(jù)后字母不同代表不同濃度的MeJA處理間差異顯著(P<0.05)。下表同。

Different letters within the same temperature and the same indicator data represent significant differences between different concentrations of MeJA(P<0.05) . The same in table 2 and table 3.

2.2 MeJA對低溫脅迫下東農(nóng)冬麥1號抗氧化酶活性的影響

由表2可知，隨著溫度的降低，處理組與對照組葉片及分蘗節(jié)的SOD活性均呈逐漸升高的趨勢，且最大值均出現(xiàn)在-25 ℃。分蘗節(jié)的SOD活性小于葉片，這可能與SOD主要存在于質(zhì)體有關。與對照組相比，4種低溫下1.0 mmol·L-1的MeJA處理均顯著提高了葉片及分蘗節(jié)的SOD活性，而0.5和2.0 mmol·L-1MeJA處理的效果在有些溫度下不明顯。

表2 MeJA對低溫脅迫下東農(nóng)冬麥1號抗氧化酶活性的影響Table 2 Effect of MeJA on antioxidant enzyme activity of Dongnong Dongmai 1 under low temperature stress

隨著溫度的降低，處理組與對照組葉片及分蘗節(jié)POD活性均呈先升高后降低的趨勢，且最大值均出現(xiàn)在-10 ℃。分蘗節(jié)的POD活性大于葉片。與對照組相比，4種低溫下1.0 mmol·L-1的MeJA處理均顯著提高了葉片及分蘗節(jié)中POD的活性，而0.5和2.0 mmol·L-1MeJA處理的效果在有些溫度下不明顯。

隨著溫度的降低，處理組與對照組葉片及分蘗節(jié)中CAT活性均呈先逐漸降低、后略有上升的趨勢，最大值均出現(xiàn)在5 ℃。分蘗節(jié)的CAT活性小于葉片。與對照組相比，4種低溫下1.0 mmol·L-1的MeJA處理均顯著提高了葉片及分蘗節(jié)中CAT的活性，而0.5和2.0 mmol·L-1MeJA處理的效果在有些溫度下不明顯。

這些結果表明，低溫脅迫下，冬小麥可以通過激活自身的抗氧化防御系統(tǒng)、提高抗氧化酶活性、清除ROS來提高抗寒性。

2.3 MeJA對東農(nóng)冬麥1號返青率的影響

越冬后，調(diào)查了不同濃度MeJA處理下東農(nóng)冬麥1號的返青率。結果表明，1.0和2.0 mmol·L-1MeJA 處理下的返青率分別為 91.5%和90.7%，顯著(P<0.05)高于對照組的84.7%和0.5 mmol·L-1MeJA處理下的86.5%。

因此，結合2.1節(jié)和2.2節(jié)的結果，篩選不同低溫脅迫下1.0 mmol·L-1MeJA處理的小麥葉片和分蘗節(jié)，進行JA響應基因TaPDF1.2和JA信號轉導途徑關鍵基因TaCOI1、TaMYC2的表達分析。

2.4 MeJA處理對低溫脅迫下東農(nóng)冬麥1號葉片和分蘗節(jié)中 TaPDF1.2、 TaCOI1、 TaMYC2表達變化的影響

從表3可知，隨著溫度的降低，對照組與1.0 mmol·L-1MeJA處理組葉片及分蘗節(jié)中TaPDF1.2、TaCOI1、TaMYC2基因的表達量均逐漸增加，-10 ℃達到最大值，此后呈下降趨勢，但-25 ℃仍高于5 ℃，整個過程表現(xiàn)為上調(diào)趨勢。與對照組相比，不同溫度下，1.0 mmol·L-1MeJA處理均顯著提高了冬小麥葉片及分蘗節(jié)中TaPDF1.2、TaCOI1、TaMYC2基因的表達量(P<0.05)；5 ℃下小麥葉片中TaCOI1基因表達量的變化不明顯。

3 討 論

本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，東農(nóng)冬麥1號在越冬期隨著溫度降低，其體內(nèi)糖含量逐漸增加；外源ABA處理提高了糖代謝關鍵酶的活性；外源SA處理提高了東農(nóng)冬麥1號蔗糖含量、蔗糖代謝相關酶的活性及基因的表達[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低，東農(nóng)冬麥1號葉片和分蘗節(jié)中可溶性蛋白、脯氨酸、可溶性糖含量逐漸增加；當溫度降至-25 ℃時，上述滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量降低，表明極寒溫度導致小麥滲透調(diào)節(jié)機制受損。外源噴施不同濃度的MeJA，均能不同程度提高東農(nóng)冬麥1號葉片和分蘗節(jié)中上述滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，其中1.0 mmol·L-1MeJA處理的效果最明顯。這可能與前人發(fā)現(xiàn)JAs誘導產(chǎn)生多種化學物質(zhì)、細胞保護分子[15]有關。

本研究發(fā)現(xiàn)，在5 ℃、0 ℃時，東農(nóng)冬麥1號葉片和分蘗節(jié)相對電導率較低，說明其在該低溫下耐受性較好；該溫度下，MeJA處理作用不明顯。隨著溫度降至-10 ℃、-25 ℃時，葉片和分蘗節(jié)的相對電導率增大，表明其受低溫脅迫程度變大；該溫度下，1.0 mmol·L-1MeJA處理顯著降低了其相對電導率，表明MeJA提高了膜的穩(wěn)定性。這與前人的研究結果[16]相一致。隨著溫度的降低，東農(nóng)冬麥1號葉片和分蘗節(jié)MDA含量逐漸升高，表明其膜脂過氧化程度加劇；不同濃度MeJA處理均降低了東農(nóng)冬麥1號葉片和分蘗節(jié)的MDA含量，說明MeJA有助于減輕低溫脅迫對東農(nóng)冬麥1號膜系統(tǒng)的傷害。

JAs作為信號分子，可激活脅迫響應中的某些信號轉導途徑[17]。有研究表明，0.1 mol·L-1MeJA處理唐菖蒲葉片，可顯著上調(diào)GhCOI1基因的表達；處理12 h內(nèi)，GhCOI1的表達量呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢[18]。還有研究表明，適宜濃度的MeJA處理可以促進擬南芥[19]、水稻[20]中COI1基因的相對表達。JA正調(diào)控擬南芥的抗凍性，外施JA可顯著提高擬南芥冷馴化誘導的抗凍能力，這與低溫處理誘導擬南芥內(nèi)源JA合成相關酶的表達、提高內(nèi)源JA的含量相一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，1.0 mmol·L-1外源MeJA處理促進了低溫脅迫下東農(nóng)冬麥1號葉片及分蘗節(jié)中TaCOI1、TaMYC2、TaPDF1.2基因的表達，其表達量變化均呈先升后降趨勢，這與前人的研究結果一致。其中TaPDF1.2是JA的響應基因，其表達量增加提示JA含量的增加；而TaCOI1、TaMYC2是JA信號轉導途徑關鍵基因，其表達量的增加可促進下游與抗寒相關基因的轉錄，進而提高植物的抗寒性。這一結果與非生物脅迫可能提高內(nèi)源JA含量相吻合，也與本課題組前期轉錄組數(shù)據(jù)顯示的低溫脅迫下TaCOI1、TaMYC2基因的表達量上調(diào)相一致。這也提示我們，東農(nóng)冬麥1號的強抗寒性與ABA、SA、JA等多種激素均有關，處于這些激素互作節(jié)點的基因如某些轉錄因子，可能在其中起到關鍵作用。對重要轉錄因子基因的功能分析將是我們下一步關注的重點。