徐喬喬，李巧云，牛吉山，于東艷，段宗彪，梁曉龍，焦志鑫

(河南農(nóng)業(yè)大學國家小麥工程技術(shù)研究中心/河南省糧食作物生理生態(tài)與遺傳改良重點實驗室，河南鄭州 450002)

小麥赤霉病(Fusarium head blight of wheat, FHB)主要由禾谷鐮刀菌(FusariumgraminearumSchw.)侵染引起，該病菌可侵染小麥苗、葉、穗等部位，引起苗腐、莖基腐、穗枯等，是溫暖潮濕地區(qū)常見的重要小麥病害[1-2]。小麥赤霉病除引起小麥產(chǎn)量、籽粒品質(zhì)和商用價值降低外，病原菌產(chǎn)生的真菌毒素，如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)等嚴重影響人和動物的健康[3-4]。我國小麥赤霉病由長江中下游地區(qū)向黃淮麥區(qū)蔓延，發(fā)病面積日漸擴大，對國內(nèi)小麥生產(chǎn)和糧食安全帶來嚴重威脅[5-7]。培育抗赤霉病品種是防治小麥赤霉病危害最經(jīng)濟、有效的方法。然而，小麥對赤霉病的抗性屬于數(shù)量性狀遺傳，受環(huán)境和遺傳因素的影響，抗病性復雜[8]，且缺乏抗赤霉病的小麥資源。小麥赤霉病侵染主要在花期，抗病性鑒定受時間限制，對小麥抗赤霉病育種有一定的影響[9-10]。

目前，已鑒定出與小麥赤霉病抗性相關(guān)的QTL(quantitative trait loci)200多個[11]。其中，SSR(simple sequence repeats)標記 Xbarc147、Xgwm493和Xgwm 533等與抗赤霉病的主效QTL基因Fhb1連鎖[12-16]。近些年，這些分子標記已經(jīng)用于小麥抗赤霉病育種工作中，但至今尚未見利用這些主效QTL培育成生產(chǎn)上推廣品種的報道。本研究以F.graminearum菌株F15為供試菌，采用微量移液器進行單花滴注接種的方法，以國家小麥工程技術(shù)研究中心小麥遺傳育種課題組的小麥品系09X15作為感赤霉病對照，對從南京農(nóng)業(yè)大學等七家單位收集的45個小麥材料進行赤霉病的抗性鑒定與農(nóng)藝性狀調(diào)查，并利用分子標記檢測這些材料攜帶Fhb1基因的情況，以期獲得農(nóng)藝性狀較好且高抗赤霉病的小麥種質(zhì)資源，加快抗赤霉病株系的選育進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及田間種植

供試的45個小麥材料收集自南京農(nóng)業(yè)大學、山東農(nóng)業(yè)大學、四川農(nóng)業(yè)大學等七個單位，其中，蘇麥 3 號用作抗赤霉病對照，09X15(高產(chǎn))用作感赤霉病對照，具體信息見表1。

供試的禾谷鐮孢菌(F.graminearum)株F15由南京農(nóng)業(yè)大學馬正強教授惠贈。

小麥材料于2014-2015、2015-2016與2016-2017三個小麥生育期(下簡稱2015、2016與2017)在河南滎陽市豫龍鎮(zhèn)試驗田種植。三次重復，隨機排列。每個材料種植一行，每平方米種植195粒，行長1 m，行距20 cm。試驗田的管理如施肥、除草、灌溉及蟲害防治同常規(guī)育種田。

1.2 赤霉病抗性鑒定

采用微量移液器進行單花滴注接種。在小麥始花期，于下午4點以后，每個重復選取10個單穗，每穗選中部1個小花注射F15孢子懸浮液10 μL，分生孢子懸浮液的濃度為5×105· mL-1，套袋保濕 3 d。接菌21 d后調(diào)查發(fā)病小穗數(shù)與總小穗數(shù)，并計算發(fā)病小穗率(percentage of diseased spiklet, PDS)。

參照國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標準(NY/T 1443.4-2007)進行小麥抗赤霉病抗性評價。小麥赤霉病嚴重度分為 5 個等級：0 級(接種小穗無可見發(fā)病癥狀)，1 級(小穗發(fā)病或相鄰個別小穗發(fā)病，病斑不擴展到穗軸)，2 級(穗軸發(fā)病，病小穗率<1/4)，3 級(穗軸發(fā)病，病小穗率1/4～1/2)，4 級(穗軸發(fā)病，病小穗率>1/2)。小麥赤霉病抗性分為 5 個等級：免疫(I，X=0)，抗(R，0

1.3 Fhb1基因的檢測

1.3.1 基因組DNA提取

小麥基因組DNA的提取參照 Saghai-Maroof 等[17]報道的 CTAB 法進行，DNA干燥后溶于 TE 緩沖液，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 分子標記檢測

與Fhb1基因連鎖的三個SSR標記 Xgwm493、 Xgwm533和Xbarc147檢測參照文獻[16]，目的條帶大小分別為210 bp、140 bp、120 bp，以蘇麥 3號為陽性對照，09X15 為陰性對照。PCR 反應體系為 10 μL，含5.0 μL 2×M5 Taq PCR Mix，上、下游引物(濃度均為10 μmol·L-1)各 0.4 μL，1.0 μL 模板 DNA(50 ng·μL-1)，ddH2O補足至 10 μL。PCR 擴增程序：94 ℃ 預變性 3 min；94 ℃變性 30 s，56/60 ℃退火 30 s(Xgwm493和Xgwm533退火溫度為60 ℃、Xbarc147退火溫度為56 ℃)，72 ℃延伸 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保存。

表1 45 份小麥材料2015-2017年的赤霉病抗性田間鑒定評價Table 1 Evaluation on resistance of 45 wheat germplasm to Fusarium head blight based on field tests from 2015 to 2017

-:數(shù)據(jù)丟失。-：Missing data.JAAS：Jiangsu Lixiahe Agricultural Science and Technology Institue.

PCR 產(chǎn)物用8%(w/v)的非變性聚丙烯酰胺凝膠，在1倍TBE緩沖液500 V電泳70 min，銀染后照相觀察并記錄。

1.4 農(nóng)藝性狀測定

分蘗能力與抗凍性：參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準(NY/T 1301-2007)測定。

株高：開花期每個材料取10株測量主莖高度，取平均值。

穗長、小穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重調(diào)查：小麥收獲期每個材料每重復選10株的主莖穗，測量穗長、小穗數(shù)、穗粒數(shù)、小穗密度(單穗的小穗數(shù)/穗長)；小麥收獲晾干后測千粒重。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料的赤霉病抗性

從表1可以看出，45份小麥材料中，共有13個材料表現(xiàn)抗赤霉病，其中，4個材料(NMAS001、寧麥9號、網(wǎng)93、蘇夫)在2015、2017生長季表現(xiàn)為抗病，1個材料(15HN018)在2016、2017，1個材料(NMAS020)在2015、2016生長季表現(xiàn)抗病，7個材料(15HN200、蘇麥3號、15HN042、H35、N553、望水白、P48)連續(xù)三年均表現(xiàn)為抗病。感病品系09X15三年的發(fā)病小穗率均大于87%。

2.2 Fhb1位點的分子檢測

用SSR標記Xgwm493、Xgwm533、Xbarc147 檢測45個小麥材料攜帶Fhb1的結(jié)果(表2)表明，有20個材料的三個分子標記檢測結(jié)果均為陽性。在13個表型鑒定為抗病的小麥材料中，有9個材料(NMAS001、NMAS020、望水白、蘇麥3號、P48、寧麥9號、網(wǎng)93、蘇夫與N553)用三個標記均擴增出目的條帶，有4個材料(15HN018、15HN200、15HN042與H35)擴增出一或兩個標記的目的條帶。在三個分子標記檢測均為陰性的9個小麥材料(09M20、10M10、節(jié)燕2000、PIC447、11-267、L658、L699、09X15、Tybalt)中，2個(節(jié)燕2000和PIC447)表型鑒定在2015年表現(xiàn)中抗(圖1，表2)。

2.3 農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

45個小麥材料的農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果(表3)表明，表型鑒定為抗病的13個小麥材料的主要農(nóng)藝性狀大多表現(xiàn)不良，NMAS001、NMAS020、望水白、蘇麥3號、P48、H35、N553 共7個材料的株高較高，均在1m以上； NMAS020、蘇夫和N553

表2 45個小麥材料 Fhb1位點的分子檢測Table 2 Detection of the major gene Fhb1 resistance to Fusarium head blight in the 45 wheat germplasm

1:陽性；0:陰性。

1:Positive; 0:Negitive.

A:分子標記 Xgwm493；B:分子標記Xgwm533；C:分子標記Xbarc147；黑色箭頭所指為目標條帶；M:DNA分子量標記；1:陽性對照(蘇麥3號)；2:陰性對照(09X15)；條帶3～47依次對應編號YP 1～45的小麥品種(系)(表1)。

表3 赤霉病抗性較好的 13 個小麥材料的主要農(nóng)藝性狀Table 3 Main agronomic traits of 13 wheat germplasm resistance to Fusarium head blight

TGW:Thousand grain weight; SD:Spikelet density.

3個材料的抗凍害能力不強；蘇麥3號、P48、網(wǎng)93和15HN042共4個材料的抗倒伏性較弱；除小麥品系15HN042外，其他材料的小穗密度都較低。綜合農(nóng)藝性狀和抗病性，以15HN018、15HN200和寧麥9號為較優(yōu)選擇。

3 討 論

本研究用微量移液器進行單花滴注接種鑒定的方法，連續(xù)三年對收集于7個單位的45個小麥材料進行了赤霉病抗性的表型鑒定，共篩選出來13個抗病材料(NMAS001、寧麥9號、網(wǎng)93、蘇夫、15HN018、NMAS020六個材料在兩年表現(xiàn)抗病，15HN200、蘇麥3號、15HN042、H35、N553、望水白、P48七個材料連續(xù)三年表現(xiàn)抗病)。用抗赤霉病主效QTLFhb1連鎖的三個SSR標記 Xgwm493、Xgwm533、Xbarc147檢測，13個抗病的小麥材料中，有9個材料用三個標記均擴增出與目標條帶，有4個材料擴增出一或兩個標記的目標條帶。在三個分子標記檢測均為陰性的小麥材料中，2個材料(節(jié)燕2000和PIC447)在2015年表現(xiàn)中抗。即用三個分子標記檢測為陽性的材料不一定表現(xiàn)抗病，部分表現(xiàn)抗病的材料用本研究所用的三個分子標記檢測不到Fhb1基因。導致分子檢測與表型鑒定結(jié)果不完全一致的主要原因可能為：① 不同小麥材料遺傳背景不同，抗病基因與其他基因互作導致其效應改變，攜帶有某個抗病基因的材料表型不一定表現(xiàn)為抗病[18-19]； ② 小麥赤霉病抗性表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳，不同小麥品系所含的抗病基因不同[20]。推測本研究中表現(xiàn)抗病而沒有檢測Fhb1基因的材料可能含有Fhb1以外的抗病基因。

前人研究表明，赤霉病抗性往往與株高等不良的農(nóng)藝性狀連鎖。有學者認為，小麥赤霉病抗性與株高呈正相關(guān)[21]。 另有學者認為，小穗密度對植株抗赤霉病侵染能力有一定影響，小穗密度越高越易感病[22]。這可能是因為植株較高、小穗密度較小的小麥穗部周圍的小環(huán)境濕度偏低，抑制了病原菌的侵入[23-24]。Gervais 等[25]檢測出 3 個赤霉病抗性主效 QTL 與植株高度 QTL 重疊，表明小麥株高與赤霉病的抗性具有一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果與這些報道相似，如抗病的13個小麥材料，有 7 個株高在 1 m 以上，除材料 15HN042 外，其他抗病材料的小穗密度都較低。

結(jié)合農(nóng)藝性狀與表型鑒定的結(jié)果，本研究共篩選出三個抗病且農(nóng)藝性狀較好的小麥品(種)系(15HN018、15HN200和寧麥9號)，可以作為小麥抗赤霉病育種的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，寧麥9號經(jīng)三個SSR標記檢測均為陽性，可以優(yōu)先考慮在小麥抗赤霉病育種中應用。其他表型抗病、分子檢測為陰性的小麥品(種)系可以作為挖掘其他抗病QTL的種質(zhì)資源。由于本研究所用的小麥材料較少、來源地偏窄，表性鑒定也僅在一個試驗地點進行，為抗赤霉病育種提供的種質(zhì)資源相對有限，因此，還需繼續(xù)收集更多的材料、進行更多優(yōu)異的鑒定以服務于小麥育種和生產(chǎn)。