董 帥，闞金紅，楊 平，馮宗云

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院大麥青稞研究中心，四川成都 611130； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081)

栽培大麥(HordeumvulgareL.)屬于禾本科大麥屬一年生作物，主要用作牲畜的飼料、啤酒釀造以及食品加工的原料等。大麥黃花葉病是我國長江中下游大麥種植區(qū)域的土傳病毒病害，是由大麥黃花葉病毒(Barleyyellowmosaicvirus, BaYMV)和大麥溫和花葉病毒(Barleymildmosaicvirus, BaMMV)兩種不同的RNA病毒感染引起的。這兩種病毒均屬于馬鈴薯Y病毒科大麥黃花葉病毒屬，都含有兩條單鏈RNA基因組序列，編碼2個前體蛋白，翻譯加工后形成十個成熟的功能蛋白[2]。BaYMV/BaYMV病毒株系分類很復(fù)雜，在世界各地都發(fā)現(xiàn)了不同的變異類型。目前，共發(fā)現(xiàn)了18個與大麥黃花葉病抗性相關(guān)的遺傳位點(diǎn)，其中15個表現(xiàn)為隱性抗性，其余3個(Rym14Hb、Rym16Hb和Rym17)為顯性抗性。rym4和rym5是位于大麥3H染色體長臂(3HL)上的隱性抗性基因，彼此是等位基因，編碼真核生物翻譯起始因子(Eukaryotic translation initiation factor 4E, EIF4E)，其抗病性不同是由氨基酸突變引起的；rym1/11是由蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶基因HvPDIL5-1編碼的隱性抗病基因，由于其基因功能丟失導(dǎo)致抗病性[4-5]。由于病毒寄生于土壤中禾谷多黏菌中，其傳播具有持久性[6]。

NAC類轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在很多植物中都有鑒定和研究。目前發(fā)現(xiàn)擬南芥中存在117個NAC轉(zhuǎn)錄因子，水稻中有151個，煙草和大豆中有152個[7-8]。其由最初發(fā)現(xiàn)的三個基因中都含有保守的NAC結(jié)構(gòu)域得名，這三個基因包括矮牽牛中的NAM(no apical meristem)，擬南芥中的ATAF和CUC2(cup-shaped cytoledon)[9]。其典型特征是在N端有一個大約160個氨基酸組成的高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，稱為NAC結(jié)構(gòu)域；C端為轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，其氨基酸序列不保守，可能與參與不同的生物學(xué)過程相關(guān)。NAC轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合能力主要取決于NAC結(jié)構(gòu)域，NAC結(jié)構(gòu)域可分成5個亞結(jié)構(gòu)域(A-E)。目前，很多研究報道發(fā)現(xiàn)NAC參與植物的多種生命活動過程，包括植物的生長發(fā)育，代謝調(diào)控及對生物脅迫或非生物脅迫的響應(yīng)過程[10]。OsNAC2是水稻中調(diào)控分蘗數(shù)的相關(guān)基因，其過量表達(dá)后植株表現(xiàn)分蘗增多的表型，但對腋芽數(shù)目沒有影響。SND1與次級纖維壁合成相關(guān)，當(dāng)其表達(dá)受抑制時次生壁厚度顯著下降，而過表達(dá)之后，大量的次生細(xì)胞增生導(dǎo)致次生細(xì)胞壁異位沉積使壁明顯加厚。過表達(dá)擬南芥ANAC019、ANAC055和ANAC072/RD26，顯著提高植株的抗旱能力[13]。ONAC106過量表達(dá)的水稻抗鹽性增強(qiáng)，同時延緩了植株的衰老[14]。水稻中的OsNAC063基因與高鹽脅迫相關(guān)，其過量表達(dá)可以增強(qiáng)植株耐鹽及滲透高壓的能力。不同的NAC轉(zhuǎn)錄因子正向或負(fù)向調(diào)控植物對逆境的耐性。在擬南芥中，AtNAP的插入突變體對鹽脅迫的抗性增強(qiáng)，而過量表達(dá)AtNAP則降低對鹽脅迫的抗性，AtNAP主要通過對AREB1的轉(zhuǎn)錄抑制來實現(xiàn)對鹽脅迫的響應(yīng)[16]。另外，很多NAC轉(zhuǎn)錄因子參與植物的抗病過程。在小麥中，TaNAC4和TaNAC8作為轉(zhuǎn)錄激活因子在植株應(yīng)對條紋病的過程中起到關(guān)鍵作用。水稻中的ONAC122和ONAC131作為正調(diào)控因子參與稻瘟病的抗性調(diào)控[18]。番茄中的SISRN1同時參與對灰霉菌和丁香假單胞菌的抗性調(diào)控[19]。

目前，對大麥中NAC轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能研究很少。大麥HvNAC6通過影響大麥體內(nèi)脫落酸(abscisic acid, ABA)的積累，參與白粉菌的抗性反應(yīng)。大麥的脅迫響應(yīng)基因HvSNAC1(Genbank登錄號JF796130)與水稻的脅迫響應(yīng)基因SNAC1及小麥的TaNAC2高度同源，過表達(dá)HvSNAC1不僅提高了植株對干旱脅迫的耐受性，同時提高對柱隔孢菌葉斑病的抗性反應(yīng)。大麥的HvNAC1不同于HvSNAC1，因其與擬南芥的AtNAC1序列相似(72.2%)，故命名為HvNAC1(Genbank登錄號AM500855)。先前研究表明HvNAC1受白粉菌侵染后表達(dá)上調(diào)，沉默HvNAC1基因的表達(dá)可以導(dǎo)致植株對白粉菌抗性降低，但是其具體機(jī)理未知[20]。本研究通過分析RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了BaMMV感染之后上調(diào)表達(dá)的NAC轉(zhuǎn)錄因子，通過序列相似性比較最終將HORVU5Hr1G011650.1命名為HvNAC1。克隆該轉(zhuǎn)錄因子并初步分析其生物學(xué)功能，以期為深入研究其調(diào)控機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究所用植物材料為大麥栽培品種Morex和Igri。其中，Morex為北美地區(qū)選育的六棱春大麥，感染BaMMV，其參考基因組序列已經(jīng)公布[23]，因此以其為材料進(jìn)行基因的克隆表達(dá)分析；Igri為歐洲二棱冬大麥，感染BaMMV，主要用于轉(zhuǎn)錄組測序分析。本生煙草(Nicotianabenthamiana)用于觀察蛋白的亞細(xì)胞定位實驗。

1.2 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

培養(yǎng)大麥品種Morex至2～4葉期和抽穗期，取整株植物，包括根莖葉以及幼嫩的穗子，分別取樣混勻。液氮冷凍后磨成粉末，采用Trizol法提取其總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，具體操作參照Superscript III cDNA第一鏈合成試劑盒(Invitrogen，美國)說明書。

1.3 大麥 HvNAC1基因的克隆與載體構(gòu)建

參照大麥HvNAC1(HORVU5 Hr1G011650.1)序列，設(shè)計攜帶Gateway克隆位點(diǎn)的特異性引物HvNAC1-attb-F(5′-GGGGACAAGTTTGTAC AAAAAAGCAGGCTTCATATGTCGATGAG CTTCTTGCATG-3′)和HvNAC1-attb-R( 5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT CGTGGTTCCAAGTAGAGCTCACTGC-3′)。以大麥總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得包含基因全長開放閱讀框在內(nèi)的序列(HORVU5Hr1G011650.1, BARLEX數(shù)據(jù)庫，https://apex.ipk-gatersleben.de/apex/f?p=284:10)，反應(yīng)體系與程序參考phusion polymerase(Thermo，美國)說明書，其中循環(huán)數(shù)為35，退火溫度為58 ℃，延伸時間為1 min 30 s。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測到的PCR產(chǎn)物并切膠回收。具體回收步驟參照普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根，北京)說明書。

為獲得后續(xù)研究使用的多個表達(dá)載體，采用Gateway的構(gòu)建方法，高效完成載體構(gòu)建工作，具體參照Gateway說明書。首先將目的片段克隆到中間載體pDONR207，檢測引物為pDONR207-F(5′-TCGCGTTAACGCTAGCATGG ATCTC-3′)、pDONR207-R (5′-GTAACATCA GAGATTT TGAGACAC-3′)，測序正確的質(zhì)粒通過重組反應(yīng)連接到表達(dá)載體pGADT7(AD)、pGBKT7(BD)和ppy2(含GFP報告基因)上，其中pGADT7-HvNAC1及pGBKT7-HvNAC1用于酵母雙雜實驗，ppy2-HvNAC1用于檢測農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草亞細(xì)胞定位。最后獲得ppy2-HvNAC1、pGADT7-HvNAC1和pGBKT7-HvNAC1的質(zhì)粒備用。

1.4 生物信息學(xué)分析

從大麥專業(yè)數(shù)據(jù)庫BARLEX(http://barlex.barleysequence.org/)中下載大麥基因HORVU5Hr1G011650.1序列及在不同組織部位的表達(dá)數(shù)據(jù)，利用BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)進(jìn)行序列同源性搜索，選取相似性較高的五個物種中的NAC轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行多序列比對，利用MEGA7 軟件進(jìn)行進(jìn)化樹分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap值為1 000。采用NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析此基因的功能結(jié)構(gòu)域。利用Cell-PLoc 2.0 (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/) 對HvNAC1編碼蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測分析。利用DP-Bind(http://lcg.rit.albany.edu/dp-bind/)進(jìn)行DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析，核定位信號在線預(yù)測網(wǎng)址為http://mleg.cse.sc.edu/seqNLS。

1.5 亞細(xì)胞定位

將ppy2-EV、ppy2-HvNAC1通過凍融法分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，涂布于LB+spe (100 μg·mL-1)固體平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)。挑取平板上ppy2-HvNAC1、ppy2-EV、P19和pCAMBIA2300-35S -DLT-RFP[24]的單克隆菌落在平板上劃線活化，具體參照Li[25]的方法。注射48 h后在激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss，德國)下觀察亞細(xì)胞定位。

1.6 酵母雙雜實驗

將構(gòu)建好的pGADT7-HvNAC1利用PEG/LiAc法轉(zhuǎn)化到Y(jié)187菌株中，具體參照Gietz等[26]的方法。pGBKT7-HvNAC1轉(zhuǎn)化到Y(jié)2H Gold菌株中，雙轉(zhuǎn)pGADT7-HvNAC1+ pGBKT7、pGBKT7-HvNAC1+ pGADT7、pGADT7-T + pGBKT7-53和pGADT7-T + pGBKT7-Lam轉(zhuǎn)化至Y2H Gold中。挑取SD/-Trp平板上的pGBKT7-HvNAC1單克隆菌落在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約為0.1，依次稀釋成10-2、10-3和10-4共4個濃度梯度，各取2 μL依次點(diǎn)在SD/-Trp/-His和SD/-Ade/-Trp/-His平板上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子活性檢測。挑取雙轉(zhuǎn)平板上的pGADT7-HvNAC1+ pGBKT7、pGBKT7-HvNAC1+ pGADT7、pGADT7-T + pGBKT7-53和pGADT7-T + pGBKT7-Lam單克隆菌落在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約為0.1，如前所述進(jìn)行稀釋，點(diǎn)在SD/-Leu/-Trp、SD/-Leu/-Trp/-His和 SD/-Ade/-Leu-/Trp/-His平板上進(jìn)行自激活檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 HvNAC1的生物信息學(xué)分析結(jié)果

前期結(jié)果中，通過對感染BaMMV大麥品種Igri的轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)HORVU5Hr1G011650.1基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)(圖1)。該基因開放讀碼框全長915 bp，其編碼的蛋白包含304個氨基酸，分子量為33.3 kDa，理論等電點(diǎn)為9.21。保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有1個NAC保守結(jié)構(gòu)域，位于14～141位氨基酸之間，E-value值為2.64E-11，顯示該蛋白屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子家族。序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因與注釋為HvNAC1基因(Genbank登錄號AM500855.1)的核苷酸序列相似性達(dá)99.56%，氨基酸編碼序列完全相同，證明該基因為HvNAC1。Cell-PLoc 2.0亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示此蛋白定位在細(xì)胞核中，在NAC結(jié)構(gòu)域中存在一個核定位信號(46～62位氨基酸)和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(64～140位氨基酸)，暗示HvNAC1具有潛在的轉(zhuǎn)錄因子功能。通過多序列比對和進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)HvNAC1蛋白與擬南芥的AtNAC007和小麥的TaNAC7同屬第二亞類，與小麥的TaNAC6A序列相似(圖2)。利用BARLEX工具在線分析HvNAC1基因的組織表達(dá)，顯示該基因在大麥的不同生長時期均有表達(dá)，在灌漿后期的籽粒以及外穎殼中表達(dá)量都較高(圖3)。

誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)誤差；**表示感染組與對照組有極顯著差異(統(tǒng)計分析用t檢驗，P<0.001)。

圖2 HvNAC1與其他物種NAC蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.2 HvNAC1的亞細(xì)胞定位結(jié)果

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時表達(dá)系統(tǒng)檢測HvNAC1的亞細(xì)胞定位。其DLT轉(zhuǎn)錄因子基因作為陽性對照，定位在細(xì)胞核中[24]，其DLT融合的RFP(35S::DLT-RFP)在紅色熒光通道下可看到明顯的細(xì)胞核內(nèi)熒光信號；陰性對照為GFP蛋白(Ubi::GFP)，其綠色熒光信號分布于整個細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HvNAC1在細(xì)胞核內(nèi)有綠色熒光信號，與陰性對照在整個細(xì)胞中都有綠色熒光信號不同。雙通道疊加實驗結(jié)果顯示，HvNAC1在細(xì)胞核中出現(xiàn)明亮的黃色，說明HvNAC1和陽性對照DLT存在共定位，均位于細(xì)胞核中(圖4)。該實驗結(jié)果與亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果一致，說明HvNAC1是作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用的。

1：幼胚；2：黃化苗；3：苗期根部；4：苗期地上部分；5：第三節(jié)間分蘗；6：幼嫩新生穗；7：新生穗；8：灌漿前期的籽粒；9：灌漿后期的籽粒；10：主穗；11：漿片；12：內(nèi)稃；13：外穎殼；14：穗軸；15：灌漿期根部；16：衰老葉。圖柱上的字母不同表示組織之間的差異顯著(P<0.05，單因素方差分析)。

圖4 HvNAC1的亞細(xì)胞定位

2.3 HvNAC1的轉(zhuǎn)錄因子功能研究

根據(jù)含BD-HvNAC1的Y2HGold菌株在篩選培養(yǎng)基上的生長情況，可以檢測HvNAC1的轉(zhuǎn)錄因子活性。與陽性對照AD-T+BD-53的生長情況相似，含有BD-HvNAC1的Y2HGold在SD/-Trp、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-His/-Ade三種培養(yǎng)基上均能正常生長，含空載體BD(負(fù)對照)的Y2HGold菌株僅在SD/-Trp上正常生長，在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-His/-Ade上不生長(圖5)。該結(jié)果表明在酵母系統(tǒng)中HvNAC1有轉(zhuǎn)錄因子激活活性。

為檢測HvNAC1是否具有自激活活性，分別構(gòu)建AD-HvNAC1和BD-HvNAC1，并轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌株。陽性對照(AD-T+BD-53)在三缺和四缺培養(yǎng)基上可正常生長，而陰性對照(AD-T+BD-Lam)不能生長。雙轉(zhuǎn)AD+BD-HvNAC1在三缺和四缺培養(yǎng)基上均正常生長(圖6)，說明HvNAC1具有轉(zhuǎn)錄因子激活活性，與單轉(zhuǎn)的結(jié)果(圖5)相同。雙轉(zhuǎn)AD-HvNAC1+BD的酵母菌株在三缺和四缺培養(yǎng)基上不生長，說明HvNAC1沒有自激活活性，可用于篩選與之互作的目標(biāo)蛋白。

綜上，HvNAC1具有轉(zhuǎn)錄因子激活活性，亞細(xì)胞定位實驗結(jié)果也揭示其定位在細(xì)胞核中，因此，我們猜測HvNAC1作為轉(zhuǎn)錄因子，可能參與調(diào)控大麥黃花葉病毒感染的相關(guān)基因。

圖5 HvNAC1的轉(zhuǎn)錄因子活性

圖6 HvNAC1的自激活檢測

3 討 論

NAC類轉(zhuǎn)錄因子作為一個轉(zhuǎn)錄因子超級家族，參與植株的生長、發(fā)育、代謝等過程，也與植物的逆境響應(yīng)有關(guān)。本研究通過分析轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果和利用基因克隆的手段，獲得了BaMMV感染之后表達(dá)上調(diào)的大麥轉(zhuǎn)錄因子HvNAC1，該基因具有NAC轉(zhuǎn)錄因子家族特有的NAC結(jié)構(gòu)域、典型的核定位信號序列和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通過進(jìn)化樹分析物種間的序列變異發(fā)現(xiàn)，該基因與小麥的TaNAC6A同源性最高。組織表達(dá)分析表明，HvNAC1在植物各個組織中都有一定的表達(dá)，但在后期灌漿籽粒中表達(dá)量最高，預(yù)測該基因可能具有一因多效，可能也參與到種子的發(fā)育過程中。有意思的是，HvNAC1在苗期根部和地上部分正常表達(dá)，BaMMV感染會導(dǎo)致該基因的表達(dá)量極顯著上調(diào)，說明大麥黃花葉病的感染與HvNAC1的上調(diào)表達(dá)相關(guān)，該基因可能參與大麥黃花葉病的感染過程。先前的研究表明，HvNAC6可以通過影響脫落酸的積累正向調(diào)控白粉菌的抗性反應(yīng)[20]，說明植物激素參與NAC轉(zhuǎn)錄因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因而我們猜測，HvNAC1的差異表達(dá)可能會誘導(dǎo)激素(比如抗病相關(guān)植物激素水楊酸、茉莉酸或者乙烯等)信號途徑，從而影響大麥黃花葉病的感染過程。

基于亞細(xì)胞定位實驗結(jié)果，HvNAC1編碼蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)，與生物信息學(xué)預(yù)測和先前報道的典型NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白的亞細(xì)胞定位相同。與之對應(yīng)的是，酵母實驗結(jié)果進(jìn)一步證實，該蛋白具有轉(zhuǎn)錄因子活性，推測HvNAC1具有調(diào)控基因表達(dá)的生物學(xué)功能，可能參與調(diào)控大麥黃花葉病相關(guān)基因的表達(dá)，從而輔助完成病毒感染。例如，在煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus, TMV)感染擬南芥的過程中，NAC轉(zhuǎn)錄因子ATAF2表達(dá)上調(diào)，并正向調(diào)控防御相關(guān)基因PR1，PR2和PDF1.2的表達(dá)，從而提高植物的抗性反應(yīng)，降低病毒的積累[27]。因此，本研究結(jié)果為后續(xù)深入研究染色質(zhì)免疫共沉淀以及HvNAC1的靶標(biāo)位點(diǎn)墊定了基礎(chǔ)。

此外，NAC轉(zhuǎn)錄因子可以通過與相關(guān)蛋白直接互作，或者通過泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑，二聚化或者蛋白的修飾完成NAC生物學(xué)功能[28]。例如大麥中與衰老相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子HvNAC013通過C端轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域與RCD1(radical-induced cell death 1)蛋白互作，從而調(diào)控衰老過程[29]。擬南芥的SnRK1(SNF1-related protein kinase)的催化亞基與NAC轉(zhuǎn)錄因子ATAF1相互作用，并使其發(fā)生磷酸化，調(diào)控ATAF1的亞細(xì)胞定位、DNA結(jié)合活性等；同時SnRK1與E3-泛素連接酶的互作促使與SnRK1互作的ATAF1被蛋白酶體降解途徑靶向并降解，從而調(diào)控植物的脅迫響應(yīng)和葡萄糖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]。未發(fā)表實驗結(jié)果表明，酵母雙雜實驗未檢測到HvNAC1與大麥黃花葉病隱性抗病基因HvEIF4E和HvPDIL5-1的蛋白互作，暗示HvNAC1參與病毒感染可能不是通過與感病基因的物理互作實現(xiàn)的，但是該結(jié)果不能排除HvNAC1與感病通路中其他蛋白存在物理互作。本研究發(fā)現(xiàn)HvNAC1在酵母系統(tǒng)的AD載體上不具有自激活活性，因此可以用于鑒定該編碼蛋白的互作因子，為后續(xù)研究其調(diào)控模式提供了工具。