甘振飛 汪璐 郭丹 李大偉

摘 要 研制了一種可拋式表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）傳感器用于檢測血清中酪氨酸酶（TYR）活性。首先制備了功能化銀納米顆粒漿料，采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)制備SERS傳感器。修飾在傳感器上的4-巰基鄰苯二酚可被酪氨酸酶催化氧化為4-巰基鄰苯二醌，引起傳感器SERS光譜的顯著變化，從而實(shí)現(xiàn)對酪氨酸酶的檢測。此傳感器對酪氨酸酶響應(yīng)快速，在優(yōu)化條件下5 min內(nèi)即可完成檢測; 特征SERS信號強(qiáng)度與酪氨酸酶濃度在1～100 U/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.28 U/mL（3σ）。由于檢測反應(yīng)的特異性和SERS技術(shù)可提供指紋信息的綜合優(yōu)勢，此傳感器有較好的抗干擾性能。血清樣品中的加標(biāo)回收率為88.1%～104.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于4%，可準(zhǔn)確反映苯甲酸的含量及其對酪氨酸酶的抑制能力。結(jié)果表明，所研制的可拋式SERS傳感器可一次性使用，適合生物樣品中酪氨酸酶的快速分析，以及酪氨酸酶抑制劑的快速篩選和檢測。

關(guān)鍵詞 表面增強(qiáng)拉曼光譜; 酪氨酸酶; 傳感器; 可拋式

1 引 言

酪氨酸酶（TYR）作為一種重要的氧化還原酶，可將鄰苯二酚類物質(zhì)催化氧化為鄰苯二醌類化合物，參與人體內(nèi)黑色素的合成[1]。研究表明，人體血清中酪氨酸酶活性正常水平約為6.5～9.5 U/mL[2]， 酪氨酸酶不足會導(dǎo)致白癜風(fēng)[3]; 過表達(dá)時，則可引起雀斑[4]和帕金森氏綜合征[5]，是黑色素瘤的標(biāo)志物之一[6]。因此檢測生物樣本中的酪氨酸酶具有重要的臨床意義[7]。目前，用于檢測酪氨酸酶的方法主要有比色法[8]、電化學(xué)法[9]和熒光法[10～13]等，這些方法或操作簡便、或靈敏度較高，但在酪氨酸酶活性實(shí)際檢測中也面臨著一些挑戰(zhàn)，如特異性不強(qiáng)、受光漂白或光毒性影響等[14～17]。

表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）能提供分子指紋信息，具有靈敏度高、檢測快速等優(yōu)勢[18～20]。SERS技術(shù)已被用于蛋白等生物分子的檢測分析，但由于蛋白分子較為復(fù)雜，SERS譜圖的解析較為困難，使其直接檢測受到限制[21]。而基于化學(xué)反應(yīng)的SERS傳感策略則有望克服此類問題，該策略將具有SERS活性和與待測物反應(yīng)的性能集于傳感器或探針，可產(chǎn)生靈敏清晰的SERS信號，只需要觀察傳感器或探針與目標(biāo)檢測物反應(yīng)前后產(chǎn)生的光譜變化即可實(shí)現(xiàn)檢測[22]。Li等[23]基于疊氮化合物與硫化氫的特異性反應(yīng)，研制了新型高靈敏特異性SERS納米傳感器，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞中硫化氫氣體信號分子的原位監(jiān)測。

絲網(wǎng)印刷技術(shù)具有印制過程均勻可控，以及網(wǎng)印產(chǎn)品重現(xiàn)性好、小巧便攜、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)[24]。Qu等[25]利用絲網(wǎng)印刷技術(shù)批量制備出穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性高，且易于保存攜帶的可拋式SERS傳感器，對羅丹明6G的檢測靈敏度可達(dá)1013 mol/L，并且方便大批量樣品檢測中一次性使用，避免交叉污染。但血清中酪氨酸酶的絲網(wǎng)印刷SERS傳感器研究尚未見報(bào)道。

本研究結(jié)合SERS和絲網(wǎng)印刷傳感器的優(yōu)勢，制備了一種用于檢測酪氨酸酶的可拋式SERS傳感器，優(yōu)化了檢測條件，為血清中酪氨酸酶檢測和酪氨酸酶抑制劑篩選提供了靈敏快捷的分析方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器和試劑

USB2000紫外-可見光譜儀（美國Ocean Optics 公司）; Ultra 55掃描電子顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）; JEM-2100高分辨透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）; BWS415便攜式激光拉曼光譜儀（美國B&W Tek公司）; AT-259A絲網(wǎng)印刷機(jī)（東遠(yuǎn)精技工業(yè)有限公司）。

AgNO3（99%）、檸檬酸三鈉（≥99%）、KCl（≥99%）、羧甲基纖維素鈉（CMC，Mw=70000，粘度≥1200 mPas）和酪氨酸酶（≥1，000 U/mg）購于Sigma-Aldrich公司; 谷胱甘肽（GSH， 95%）、尿素（99%）和NaCl（≥99.5%）購于阿拉丁試劑有限公司。Gibco 胎牛血清購于Thermo Fisher 公司。NaClO（99.7%）和H2O2（30 %）購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水（18 MΩ cm）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 4-巰基鄰苯二酚的合成 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將0.85 g 3，4-二甲氧基苯基甲硫醇冰浴冷卻至

10℃; 加入2.50 g BBr3，反應(yīng)12 h; 然后分離有機(jī)相，干燥，提純得到4-巰基鄰苯二酚[26]。質(zhì)譜表征顯示， 合成物在m/z 142.0090處有一個強(qiáng)峰，與4-巰基鄰苯二酚相吻合。

2.2.2 絲網(wǎng)印刷漿料的制備

按照文獻(xiàn)[27]方法制備銀納米顆粒，制備好的銀膠于4℃保存。制備絲網(wǎng)印刷銀漿時，在銀納米顆粒上修飾4-巰基鄰苯二酚， 6500 r/min離心5 min，移除99%上層清液，與4.0%羧甲基纖維素鈉（CMC）按照3∶1（V/V）混合，制得絲網(wǎng)印刷漿料。

2.2.3 酪氨酸酶傳感器的制備 依據(jù)設(shè)計(jì)的陣列網(wǎng)板，參考文獻(xiàn)[25]中的方法，在紙質(zhì)基體上利用絲網(wǎng)印刷機(jī)分層印刷碳漿和4-巰基鄰苯二酚功能化的銀納米顆粒漿料，印制SERS傳感器陣列。主要印制過程為：將紙質(zhì)基體與陣列網(wǎng)板分別固定于絲網(wǎng)印刷機(jī)的相應(yīng)位置并將印刷漿料放置于網(wǎng)板一端，利用刮刀擠壓漿料透過陣列圖形區(qū)域，然后將印制好的傳感器陣列從絲網(wǎng)印刷機(jī)中取出烘干，保存。

2.2.4 酪氨酸酶的檢測 酪氨酸酶用K2HPO4-KH2PO4緩沖液（50 mmol/L， pH=5.6）溶解，分裝后，于

20℃避光儲存，使用時取出，在37℃融解。將酪氨酸酶溶液（25 kU/mL）梯度稀釋，加入到1 mL K2HPO4-KH2PO4緩沖液（10 mmol/L， pH=7.4）中，獲得不同濃度的酪氨酸酶溶液。將SERS傳感器插入溶液，于37℃孵育5 min，取出傳感器，采集拉曼光譜。血清加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)采用相似步驟完成檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測原理

通過在銀納米顆粒上修飾新合成的4-巰基鄰苯二酚，并將其印刷到已印有碳層的紙質(zhì)基體上，制備可拋型酪氨酸酶SERS傳感器。如圖1所示，在氧氣存在下，酪氨酸酶可將傳感器上的4-巰基鄰苯二酚的羥基催化氧化為羰基，導(dǎo)致傳感器的SERS光譜發(fā)生變化，并產(chǎn)生新的SERS譜峰?；谶@一特征性SERS光譜信號，可實(shí)現(xiàn)對生物樣品中酪氨酸酶的檢測分析。

3.2 傳感器表征

所制備的SERS傳感器陣列有10×4個傳感點(diǎn)位，每個傳感點(diǎn)位約為28 mm2，可裁剪為單個可拋式傳感器，獨(dú)立完成便攜檢測（圖2A）。掃描電鏡表征顯示（圖2B），傳感器上的銀納米顆粒為球形，直徑約50 nm，且粒徑分布均勻，具有較好的SERS增強(qiáng)活性[28]。進(jìn)一步考察發(fā)現(xiàn)，傳感器與酪氨酸酶孵育后，SERS光譜發(fā)生明顯變化，在484 cm1處出現(xiàn)新的信號峰（圖2C）。通過密度泛函理論計(jì)算可知，484 cm1處譜峰主要來自于CO振動，而784、898和1071cm1處譜峰歸因于COH與CCC的振動疊加。如前所述，這是由于酪氨酸酶催化氧化作用所致，表明傳感器對酪氨酸酶有優(yōu)良的SERS響應(yīng)能力。此外，傳感器制備的重現(xiàn)性考察實(shí)驗(yàn)表明，隨機(jī)選取10個傳感點(diǎn)位的SERS譜圖基本一致（圖3A），并且在1071 cm1處代表性譜峰強(qiáng)度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以內(nèi)（圖3B），重現(xiàn)性良好。

3.3 檢測條件的優(yōu)化

優(yōu)化了孵育pH值、溫度和時間等酪氨酸酶的檢測條件。由圖4A和圖4B可知，pH值從5.0增長到7.4時，表面增強(qiáng)拉曼光譜中拉曼位移484 cm

1處的峰強(qiáng)度（I484）隨之增強(qiáng)，pH值>7.4時，I484減弱; 檢測溫度在37℃、pH=7.4時，I484最強(qiáng); 這可能是由于此時酪氨酸酶活性最大[29]，因此更適合傳感器檢測。由圖4C可見，I484隨孵育時間延長而增強(qiáng)，時間超過5 min后，I484基本保持不變，表明酪氨酸酶催化反應(yīng)達(dá)到平衡，所以選擇酪氨酸酶的檢測時間為5 min。即本傳感器可以在5 min內(nèi)完成檢測，實(shí)現(xiàn)對酪氨酸的快速分析[30～32]。

3.4 抗干擾性

3.5 傳感器分析性能

3.6 血清樣品分析

為評估所研制的傳感器分析生物樣品中酪氨酸酶的可行性，對胎牛血清（FBS）中TYR進(jìn)行了檢測。如表2所示，4個加標(biāo)水平下，酪氨酸酶的回收率在88.1%～104.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.5%～3.4%之間，良好的檢測性能可能是由于酶催化反應(yīng)的專一性和SERS傳感器的高重現(xiàn)性和選擇性，表明所研制傳感器可用于血清樣品中酪氨酸酶的檢測。

3.7 TYR抑制劑的篩選和評估

4 結(jié) 論

合成了4-巰基鄰苯二酚功能化銀納米顆粒漿料，采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)制備了可拋式SERS傳感器，用于檢測TYR。此傳感器重現(xiàn)性高，SERS信號相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%; 在優(yōu)化條件下，5 min內(nèi)即可完成TYR的快速檢測; 傳感器制備和檢測方法簡單，抗干擾能力強(qiáng)，對TYR的檢出限低于0.3 U/mL，血清樣品中加標(biāo)回收率為88.1%～104.6%。此傳感器在酪氨酸酶活性分析及其抑制劑篩選檢測相關(guān)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用潛力。

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