徐云

摘要：目的?建立HPLC法測(cè)定濕疹洗劑中苦參堿的含量。方法?采用C18柱（250 mm×4.6mm，5μm）色譜柱;流動(dòng)相為：甲醇-乙腈-磷酸鹽緩沖液（10：10：80）為流動(dòng)相;流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長215nm。結(jié)果?苦參堿的線性范圍為0.55～2.75μg，r=0.9997，平均回收率為99.53%，RSD=1.47%.結(jié)論?該方法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，回收率高，可作為濕疹洗劑的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：濕疹洗劑;苦參堿;HPLC

中圖分類號(hào)：R284?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：1007-2349（2019）03-0068-03

濕疹是一種可在一年四季內(nèi)發(fā)生的常見疾病，可以發(fā)生在任何年齡組，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，它是由內(nèi)因與外因相互作用，以及淺表表皮和真皮的炎癥性皮膚病引起的，多發(fā)于頭部和臉部、肩部、胸部等部位。該病多為對(duì)稱分布，常伴有嚴(yán)重瘙癢等癥狀，病情復(fù)雜，時(shí)間長，易復(fù)發(fā)。近年來，濕疹患者逐年增多[1]。目前尚無有效的治療方法，中醫(yī)藥在濕疹治療方面取得了一定的成效，顯示出自身的優(yōu)勢(shì)。濕疹洗劑系臨床經(jīng)驗(yàn)方，由苦參、炒黃柏、生地、炒白術(shù)等10味中藥組成的復(fù)方制劑，具有清熱燥濕，祛風(fēng)止癢的作用，臨床上用于濕疹疥廯引起的皮膚瘙癢等病癥。方中苦參為主藥，具有清熱燥濕、殺蟲、利的功效[2]，據(jù)報(bào)道，苦參水煎液和苦參堿均有顯著的抗炎作用。許多臨床資料證明，苦參堿的抗炎機(jī)制與其抑制磷脂酶A2（PLA2）活性有關(guān)。國內(nèi)外專家已證實(shí)苦參對(duì)急慢性瘙癢模型有止癢作用。此外，氧化苦參堿注射液治療急性和亞急性濕疹的總有效率為94%，慢性濕疹的總有效率為79%[3]。黃柏是蕓香科黃檗和黃皮樹的干樹皮，味苦性寒，歸腎、膀胱和大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒、退熱的功能?，F(xiàn)代中藥研究發(fā)現(xiàn)，黃柏中含有多種生物堿，主要為小檗堿，其余為黃柏堿、黃柏酮、黃柏內(nèi)酯、白鮮內(nèi)酯、藥根堿、木蘭花堿、掌葉防己堿等[4]，具有抗細(xì)菌毒素、抗炎、抗高血壓和利尿作用。其中小檗堿對(duì)金黃色葡萄球菌等有較強(qiáng)的抑制作用，而金黃色葡萄球菌是濕疹的主要細(xì)菌，在某些濕疹的發(fā)生、維持和加重中起作用[5]。黃柏中小檗堿能顯著降低金黃色葡萄球菌毒素的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)菌對(duì)白細(xì)胞的吞噬作用，減少炎癥的損傷[6]。因此，為了有效控制濕疹洗液的質(zhì)量，確保制劑的有效性和安全性，以苦參堿作為指標(biāo)成分，采用高效液相色譜法直接測(cè)定苦參堿，結(jié)果滿意，特異性強(qiáng)，操作簡便，內(nèi)容報(bào)告如下。

1?儀器與試藥

Agilent高效液相色譜儀（四元泵，DAD檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器），Agilent1200化學(xué)工作站;FA1104電子分析天平（上海精科天平廠）。HN1006型超聲波清洗機(jī)（廣州華南超聲設(shè)備廠生產(chǎn)）。苦參堿對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：：160805-200508）;濕疹洗劑（系自制）;水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純。

2?方法

2.1?色譜條件?色譜柱：Agilent C18柱（250 mm×4.6mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇-乙腈-磷酸鹽緩沖液（10：10：80）;流速：1.0 mL/min;柱溫：30℃;檢測(cè)波長：215nm;進(jìn)樣量10μl。在此條件下，苦參堿與其他色譜峰分離良好，理論板數(shù)以苦參堿峰計(jì)算，應(yīng)不低于3000.

2.2?對(duì)照品溶液的制備?取苦參堿對(duì)照品適量，精密稱定苦參堿2.750mg，置25ml量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液（0.11mg/ml）[7].

2.3?供試品溶液制備?取本洗劑，搖勻，精密吸取5 mL，加濃氨試液2 mL，用三氯甲烷50ml萃取3次，合并三氯甲烷，蒸干，殘?jiān)眉状既芙夂筠D(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用0.45μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得[8]。

2.4?陰性對(duì)照試驗(yàn)?按處方取缺苦參的陰性對(duì)照藥，按供試品溶液制備方法，制得陰性對(duì)照溶液，進(jìn)樣，依法測(cè)定，結(jié)果陰性對(duì)照液在相同位置處無與苦參堿相對(duì)應(yīng)的色譜峰，表明處方中其它藥材和輔料不干擾苦參堿的測(cè)定。

2.5?線性關(guān)系的考察?分別精密吸取對(duì)照品溶液5，10，15，20，25μL進(jìn)樣，以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）進(jìn)行回歸，苦參堿的回歸方程為Y=4315.3X+147，r=0.9997，表明進(jìn)樣量在0.55～2.75μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6?精密度實(shí)驗(yàn)?精密吸取上述對(duì)照品溶液10μL，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定阿魏酸峰面積值，計(jì)算苦參堿RSD為1.52%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.7?穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)?精密吸取同一供試品溶液10μL，分別于0，2，4，8，24 h測(cè)定苦參堿峰面積，結(jié)果RSD為1.69%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8?重復(fù)性實(shí)驗(yàn)?精密稱取同一批次的樣品6份，按照供試品溶液制備方法得到供試品溶液，依上述色譜條件測(cè)定苦參堿的含量，其RSD為1.93%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9?加樣回收率實(shí)驗(yàn)?采用加樣回收法測(cè)定，取已知含量的樣品（批號(hào)：170810），精密移取5 mL，精密加入苦參堿對(duì)照品適量，制成各自的供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

2.10?樣品測(cè)定?取3批樣品，分別精密移取本品5 mL，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，10μL進(jìn)樣。結(jié)果見表2。

3?討論

根據(jù)苦參的生質(zhì)，筆者參考2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）收載的苦參原藥材含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件，采用乙腈‐無水乙醇‐3%磷酸溶液（80：10：10）[9]進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果表明供試品中苦參堿峰與其他雜質(zhì)峰達(dá)不到基線分離。筆者根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10，11]，選擇了3種流動(dòng)相：①乙腈-水（加水0.04%三乙胺，磷酸調(diào)pH至7.00（20：80）;②乙腈-0.05%磷酸溶液（5：95）;③甲醇-乙腈-磷酸鹽緩沖液（10：10：80）。經(jīng)多次測(cè)試結(jié)果表明，前兩種流動(dòng)相所得峰形較寬，含雜質(zhì)多，而采用③甲醇-乙腈-磷酸鹽緩沖液（10：10：80）為流動(dòng)相所得樣峰形好，干擾成分少，在此流動(dòng)相條件下，峰形及分離度均良好，能滿足濕疹洗劑中苦參堿的含量測(cè)定要求，故選此作為含量測(cè)定的流動(dòng)相。我們研究了樣品的制備方法。開始將樣品溶液經(jīng)水稀釋過濾后，按照上述的色譜條件進(jìn)樣測(cè)試，結(jié)果干擾成分較多，嚴(yán)重影響了苦參堿等成分的分離。接下來，我們把樣品用氨水堿化，目的是增加生物堿的脂溶性，然后用氯仿萃取，生物堿與其他成分分離，大大提高了純化效果，苦參堿的分離效果較好，同時(shí)也簡化了文獻(xiàn)[12]中樣品的前處理方法。

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