陳秀竹，常 迪*，黃啟震，王 瑞，王天坤，盛熙暉，齊曉龍，王相國，郭 勇，刑 凱，倪和民，谷傳慧

(1.北京農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.昌平區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102200； 3.北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京100029)

子宮內(nèi)膜炎是奶牛常見的產(chǎn)科疾病，主要病因是子宮內(nèi)侵入病原微生物導(dǎo)致子宮內(nèi)膜發(fā)生炎癥。子宮內(nèi)膜炎主要損傷子宮內(nèi)膜的上皮細(xì)胞，使子宮內(nèi)積膿，并影響早期胚胎著床等生殖過程，導(dǎo)致奶牛的繁殖性能下降[1]。臨床研究顯示，奶牛子宮內(nèi)膜炎主要分為臨床型子宮內(nèi)膜炎和亞臨床型子宮內(nèi)膜炎兩種類型。由于各種炎癥在子宮內(nèi)侵襲的程度上存在差異，所以修復(fù)子宮內(nèi)膜所需要的時(shí)間存在差異，進(jìn)而對母牛繁殖性狀的影響也存在差異。國內(nèi)外都有大量該病的研究報(bào)道，不同地區(qū)子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病情況各有不同[2]。另外，由于患病牛自身的免疫能力存在差異，也導(dǎo)致奶牛的發(fā)病情況有所不同[3]。當(dāng)前，該病的診斷方法有直腸檢查這類常規(guī)方法，還包括細(xì)胞學(xué)檢查以及PCR技術(shù)在內(nèi)的新技術(shù)[4]，應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)對母牛遺傳免疫進(jìn)行了相關(guān)的分析和研究，對致病菌進(jìn)行快速的歸類，以尋找到更好的預(yù)防和治療子宮內(nèi)膜炎最有效的辦法。目前一項(xiàng)研究顯示，在牛對由子宮內(nèi)膜炎等細(xì)菌感染導(dǎo)致的疾病的抵抗能力方面，細(xì)胞白介素1受體輔助蛋白(interleukin 1 receptor accessory protein，IL1RAP)基因可對該種免疫力加以提高，并且IL1RAP是牛子宮內(nèi)膜炎的抗性候選基因[4]。

IL1RAP最先被鑒定為小鼠細(xì)胞中的IL-1型受體復(fù)合物的亞基，其有助于受體對IL-1的親和力，并且是IL-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的基因[5-10]。IL1RAP是IL-1信號(hào)傳導(dǎo)中所需的受體配偶體，表達(dá)翻譯形成膜IL1RAP和可溶性IL1RAP 兩種形式，并且在機(jī)體中廣泛表達(dá)[11-12]。有研究表明，IL1RAP可以當(dāng)做新型的白血病干細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白[13]。也有研究表明，IL1RAP在人類子宮內(nèi)膜異位癥患者中的外周血以及子宮組織中表達(dá)下降，而子宮內(nèi)膜異位癥導(dǎo)致子宮發(fā)炎[14]。探明IL1RAP在健康奶牛與患子宮內(nèi)膜炎奶牛間的表達(dá)差異，初步驗(yàn)證IL1RAP與奶牛子宮內(nèi)膜炎的關(guān)系，為將IL1RAP作為奶牛子宮內(nèi)膜炎的抗性基因提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用荷斯坦奶牛，挑選年齡相仿且經(jīng)產(chǎn)2次的健康奶牛3頭及經(jīng)產(chǎn)2次的患子宮內(nèi)膜炎奶牛3頭。

1.2 樣品采集與檢測

觀察奶牛外陰部位是否存在污濁分泌物進(jìn)行初步選定，操作人員通過奶牛的陰道分泌物涂片，鑒別奶牛是否患有子宮內(nèi)膜炎，通過鑒別子宮內(nèi)病灶聲像顯示圖并且通過儀器測量子宮頸的直徑厚度以及依據(jù)子宮內(nèi)液體的反射強(qiáng)度來確診患病奶牛。

將經(jīng)產(chǎn)健康奶牛3頭，經(jīng)產(chǎn)患子宮內(nèi)膜炎奶牛3頭，屠宰后分別取其子宮組織，然后將子宮組織迅速剪成1 cm見方的小組織塊，隨后快速置入液氮中處理，待冷凍完全后，將其置于處理過的離心管中并作標(biāo)記，在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將子宮組織塊進(jìn)行熒光PCR技術(shù)檢測,以GAPDH為參照，將cDNA樣品稀釋10倍，作為模板上機(jī)檢測，所用等引物序列如表1。

western blot檢測，組織塊提取蛋白后，利用兔抗IL1RAP多克隆抗體以及Anti-rabbit IgG二抗進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of genes

利用Excel軟件匯總數(shù)據(jù)，熒光PCR數(shù)據(jù)分析方法為2-ΔΔCt相對定量分析方法，采用SPSS軟件對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛的IL1RAP mRNA相對表達(dá)量

熒光定量PCR內(nèi)參基因GAPDH以及目的基因IL1RAP的擴(kuò)增曲線如圖1，熒光定量PCR內(nèi)參基因GAPDH及目的基因IL1RAP的溶解曲線如圖2。通過擴(kuò)增曲線可以看出反應(yīng)效果良好，并且通過溶解曲線分析IL1RAP以及GAPDH基因分別在81.97 ℃及86.67 ℃處，出現(xiàn)單一產(chǎn)物峰。

以內(nèi)參基因GAPDH為內(nèi)標(biāo)，SYBRGreen染色法對IL1RAP mRNA在奶牛子宮組織中的相對表達(dá)量進(jìn)行PCR檢測，其中健康奶牛子宮組織中IL1RAP mRNA的相對表達(dá)量顯著高于患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮組織中IL1RAP的相對表達(dá)量(P<0.05),如圖3所示。

圖1 內(nèi)參基因GAPDH的擴(kuò)增曲線(左)目的基因IL1RAP的擴(kuò)增曲(右)Fig.1 Amplification curve of the internal reference gene GAPDH (left) Amplification of the target gene IL1RAP (right)

圖2 內(nèi)參基因GAPHD的溶解曲線(左)目的基因IL1RAP的溶解曲線(右)Fig.2 Dissolution curve of the internal reference gene GAPDH gene (left) Dissolution curve of target gene IL1RAP (right)

圖3 健康奶牛與患病奶牛子宮組織中IL1RAP的mRNA相對表達(dá)量Fig.3 mRNA Relative expression of IL1RAP in uterus tissue of healthy and diseased cows

2.2 奶牛的IL1RAP 蛋白相對表達(dá)量

通過Western Blot電泳試驗(yàn)，以β-catin為內(nèi)參基因，得出電泳圖如圖4所示。圖5為IL1RAP 蛋白在奶牛子宮組織中的相對表達(dá)量，可以看出健康奶牛子宮組織中IL1RAP蛋白的相對表達(dá)量極顯著高于患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮組織中IL1RAP蛋白的相對表達(dá)量(P<0.01)，IL1RAP蛋白相對表達(dá)量與奶牛子宮內(nèi)膜炎存在相關(guān)性。

健康奶牛1號(hào)(Z1)子宮組織與患子宮內(nèi)膜炎奶牛1號(hào)(H1)子宮組織中IL1RAP蛋白的表達(dá)量圖。健康奶牛2號(hào)(Z2)子宮組織與患子宮內(nèi)膜炎奶牛2號(hào)(H2)子宮組織中IL1RAP蛋白的表達(dá)量圖。健康奶牛3號(hào)(Z3)子宮組織與患子宮內(nèi)膜炎奶牛3號(hào)(H3)子宮組織中IL1RAP蛋白的表達(dá)量圖圖4 奶牛子宮組織中IL1RAP蛋白表達(dá)檢查結(jié)果 The expression level of IL1RAP protein in uterus tissue of healthy cow No. 1 (Z1) and uterus of endometritis cow No. 1 (H1). The expression level of IL1RAP protein in uterus tissue of healthy cow No. 2 (Z2) and uterus tissue of endometritis cow No. 2 (H2). Expression of IL1RAP protein in uterus tissue of healthy cow No. 3 (Z3) and endometritis cows No. 3 (H3)Fig.4 Results of IL1RAP protein expression in cow uterus tissue

圖5 IL1RAP 蛋白在奶牛子宮組織中的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression of IL1RAP protein in dairy uterus

2.3 討 論

IL1RAP首先被鑒定為小鼠細(xì)胞中的IL-1受體復(fù)合物的亞基，其有助于受體對IL-1的親和力[5,6]，是IL-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的物質(zhì)[7-10]。試驗(yàn)表明，人類編碼IL1RAP的基因位于染色體3q28上[12]，通過表達(dá)翻譯，形成膜 IL1RAP 和可溶性 IL1RAP 兩種形式。研究發(fā)現(xiàn)，IL1RAP在慢性粒細(xì)胞白血病干細(xì)胞上表達(dá)顯著升高，在正常造血干細(xì)胞上不表達(dá)或低表達(dá)。IL-1信號(hào)傳導(dǎo)需要一型IL-1受體(IL-1RI)和IL-1受體輔助蛋白(IL-1RAP)作為受體配偶體。研究發(fā)現(xiàn)，IL1RAP已被證明可以改善膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，主要由于其有效的抗炎特性、促血管生成和生長特性[15]。可溶性IL1RAP在人血清中檢測到，似乎通過增加IL1與sIL1R2結(jié)合的親和力來發(fā)揮IL1反調(diào)節(jié)作用[16]，而子宮內(nèi)膜異位癥患者外周血中sIL1R2濃度降低[17,18]，可以推出人子宮內(nèi)膜異位癥患者外周血中IL1RAP減少。白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)在損傷感染時(shí)以及疾病過程中被合成釋放，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，相當(dāng)于一種促炎性的細(xì)胞因子，其具有大范圍的表達(dá)譜，大量的細(xì)胞都可以進(jìn)行表達(dá)，當(dāng)機(jī)體處于正常狀況下的時(shí)候，其通常不會(huì)表達(dá)，只有當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥的時(shí)候，在炎癥信號(hào)的刺激作用下，能夠?qū)⑵溥M(jìn)行快速的組合和分泌，在慢性炎癥和腫瘤的發(fā)展過程中起到了重要作用[19]。而IL1RAP存在于IL-1β負(fù)調(diào)控通道上，因此可以推斷，該基因與牛子宮內(nèi)膜炎抗性可能存在著某種相關(guān)關(guān)系[23]。IL1RAP表達(dá)和中性粒細(xì)胞在負(fù)相關(guān)方向上運(yùn)動(dòng)[24]。研究顯示，患有子宮內(nèi)膜炎的牛的中性粒細(xì)胞明顯提高(P<0.05)[4]。在反芻動(dòng)物血液中，中性粒細(xì)胞占比很大(45%左右)，是對細(xì)菌進(jìn)行的第一道防線的抵御，在炎癥產(chǎn)生以后，他們是首批進(jìn)入炎癥區(qū)的細(xì)胞，由此可以判斷，在如子宮內(nèi)膜炎等由細(xì)菌感染引起的疾病中，ILIRAP可以提高對其的抵抗能力，能夠成為牛對子宮內(nèi)膜炎的抗性候選基因。

本試驗(yàn)結(jié)果得出患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮組織中IL1RAP mRNA以及蛋白相對表達(dá)量均顯著低于健康奶牛子宮組織中IL1RAP mRNA以及蛋白相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)可能與子宮內(nèi)膜炎的病理生理學(xué)有重要關(guān)聯(lián)。實(shí)際上，IL1RAP包含兩種形式，可溶性IL1RAP是IL-1的主要特異性抑制劑，并因此在促炎細(xì)胞因子的下調(diào)中起重要作用，導(dǎo)致炎癥效應(yīng)[25-27]。IL1RAP較低的循環(huán)水平可能與子宮內(nèi)膜炎病理生理學(xué)中的可溶性IL1RAP表達(dá)缺乏相關(guān)，導(dǎo)致IL1介導(dǎo)的炎癥的反調(diào)節(jié)機(jī)制顯著缺乏[25,27-29]。

3 結(jié) 論

患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮組織中IL1RAP的mRNA以及蛋白相對表達(dá)量比健康牛子宮組織中的相對表達(dá)顯著降低，為證明IL1RAP為奶牛子宮內(nèi)膜炎的抗性基因提供支撐。