張 超，尚潤東，劉宇璇，楊國慶，李 璐，施 磊，靳永勝

(1.北京市城市管理研究院，北京 100028； 2.北京農學院 生物科學與工程學院，北京102206)

2011年,北京市生活垃圾總量達634.9萬t,日產量約1.74萬t[1]，2015年,垃圾產生量已經達到790.33萬t[2]。在多數(shù)發(fā)展和發(fā)展中國家，處理垃圾的主要手段是垃圾填埋[3]，垃圾在填埋的過程中，會產生大量的垃圾滲濾液，目前中國的垃圾滲濾液產量已經達到每年3 000萬t以上[4]，而1 t滲濾液約相當于100 t城市污水所含污染物的濃度[5]。氨氮、TN、COD是垃圾滲濾液的主要污染物。Loukidou[6]等采用移動床生物濾池處理滲濾液，氨氮的去除率達85%，Lo[7]等采用SBR的方式處理垃圾滲濾液，氨氮的去除率達99%。但是這些研究只是實現(xiàn)了氨氮的去除，滲濾液中的TN仍然很高。王凱等[4]認為如果通過生化工藝可以直接實現(xiàn)滲濾液TN的高效去除，會極大地降低處理成本。尹文俊等[8]認為利用生化法實現(xiàn)垃圾滲濾液的深度脫氮，是未來垃圾滲濾液處理技術的發(fā)展方向。因此篩選出能高效降解滲濾液中氨氮或TN的菌株，對垃圾滲濾液處理生化工藝中TN的高效去除具有重要意義。

此研究在高濃度的初始氨氮濃度條件下從北京市某垃圾填埋廠滲濾液中篩選出一株能高效降解氨氮的菌株SDB1-2，并對其進行了氨氮濃度的耐性實驗及在實驗室條件下對實際垃圾滲濾液處理效果的研究，旨在為開發(fā)垃圾滲濾液處理生化工藝中氨氮、TN或COD的高效去除提供理論依據(jù)和技術支持。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 垃圾滲濾液來源 篩選出的優(yōu)勢菌株所用的滲濾液來源于北京市南宮堆肥廠。對滲濾液應用研究中所用垃圾滲濾液從北京市某垃圾綜合處理填埋場獲得，檢測該垃圾滲濾液氨氮含量1 034 mg/L，總N含量1 216 mg/L,COD 22 000 mg/L。

氨氮的測定方法：納氏試劑分光光度法?？侼的測定方法：過硫酸鉀雙波長分光光度法。COD的測定方法:德國WTW公司COD試劑盒1.14541檢測。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基：(NH4)2SO49.44 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g，K2HPO41.0 g，KH2PO40.25 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g， C6H5O7Na3·2H2O 39.0 g，微量元素1 mL, dH2O 1 000 mL，調pH值6.8。

篩選培養(yǎng)基：(NH4)2SO49.44 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.4 g，K2HPO41g，KH2PO40.25 g/L ,MgSO4·7H2O 0.5 g，C6H12O610.0 g，微量元素1 mL, dH2O 1 000 mL，調pH值6.8。

分離培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基中加入20%瓊脂。

1.1.3 主要儀器和藥品 主要儀器有上海儀電分析儀器有限公司生產的752N型紫外可見分光光度計、BIO-RADPCR反應擴增儀、上海精密科學儀器有限公司生產的型號FA1004N的萬分之一天平,上海精宏實驗設備有限公司型號LHZ-111落地式恒溫振蕩器，北京金利順騰科技有限公司型號YT-CJ-1ND超凈工作臺，天津taisite電熱恒溫培養(yǎng)箱等。主要藥品:氯化銨、硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、七水合硫酸亞鐵，七水合硫酸鎂、蔗糖、檸檬酸鈉、酒石酸鉀鈉、過硫酸鉀均購自國藥集團化學試劑有限公司，那氏試劑購自天津久木科技有限公司，所用試劑均為國產分析純。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的分離純化和篩選 取滲濾液5 mL，加入到滅菌后的100 mL富集培養(yǎng)基中，恒溫震蕩培養(yǎng)(30 ℃，180 r/min)，連續(xù)富集5 d，用稀釋涂布平板法以10-4、10-5、10-6三個梯度分別涂布于分離培養(yǎng)基，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)。用接種針挑出所有單菌落，以三線法在分離培養(yǎng)基上純化5到6次，直致純化出單一菌落，對篩選出的菌株進行編號，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 降解氨氮菌株的初步篩選 把純化后的單菌落分別接種到100 mL經121 ℃、滅菌20 min的篩選培養(yǎng)基中，并設CK，每隔24 h檢測1次培養(yǎng)基中的氨氮，連續(xù)檢測5次，計算氨氮降解率。氨氮降解率(%)=(CCK-C樣品)/Cck×100。式中：C，氨氮含量(mg/L)。

1.2.3 菌株的形態(tài)特征及分子鑒定 挑取SDB1-2單菌落以三線法接種于分離平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取單菌落于20 μL無菌dd H2O中，混勻，以其為模版用細菌擴增的通用引物27f和1492r擴增其16s rRNA基因序列，擴增之后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標條帶大小約1 500 bp，將擴增成功的PCR產物送到北京博邁德基因技術公司測序，測序結果回來之后在NCBI上進行序列比對，并用MEGA 5.0做相似性分析。

1.2.4 不同初始氨氮濃度設置 氨氮初始濃度分別為100、500、750、1 000、2 000 mg/L，共5個條件；C/N比為10；C源為蔗糖；不調pH值，接種量1%，每個條件設2個重復，1個CK，每隔24 h檢測1次培養(yǎng)基中的氨氮，連續(xù)檢測5次，計算氨氮降解率。

1.2.5 SDB1-2菌株對滲濾液的處理 對滲濾液分別設121 ℃、滅菌20 min和不滅菌，每個條件設3個平行樣，以不接菌滲濾液為CK，設2個對照，不調pH。

具體操作如下，用接種環(huán)挑取SDB1-2單菌落接種到裝有100 mL篩選培養(yǎng)基中，置于28 ℃、120 r/min 搖床中培養(yǎng)24 h，以1%的比例接種到裝有100 mL垃圾滲濾液的三角瓶中，同CK一起，置于28 ℃、120 r/min 搖床培養(yǎng)，每隔24 h檢測1次滲濾液中氨氮、總氮、COD，連續(xù)檢測5次。分別計算氨氮、TN、COD降解率。TN降解率(%)=(CCK-C樣品)/Cck×100。式中：C，TN含量(mg/L)；COD降解率(%)=(CCK-C樣品)/Cck×100。式中：C，COD含量(mg/L)。

2 結果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征及分子鑒定

2.1.1 菌株的形態(tài)特征 SDB1-2培養(yǎng)后單菌落個體較大，菌落灰白色，濕潤黏稠，邊緣規(guī)則，突起生長，正反面顏色相同。在顯微鏡下觀察菌體細胞短桿狀，革蘭氏染色陰性(圖1)。

2.1.2 分子鑒定結果 SDB1-2菌株全長1 445 bp，把測序結果在http://archive-dtd.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站上進行序列比對，并用MEGA 5.0做相似性分析(如圖1)，發(fā)現(xiàn)該菌株的基因序列與已登記Klebsiellapneumoniae( JN644536.1)肺炎克雷伯氏菌，序列同源性最高。因而確定該菌株為肺炎克雷伯氏菌屬。將篩選得到的SDB1-2菌株命名為肺炎克雷伯氏菌CitrobacterfreundiiSDB1-2,簡稱SDB1-2。

圖1 SDB1-2光學顯微鏡圖(革蘭氏染色)和系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Optical micrographs and Phylogenetic tree of SDB1-2

2.2 高效降解氨氮菌株的初步篩選

由圖2可知，該標準曲線R2為0.999，方程式為，y=0.186x+0.001，根據(jù)該標準曲線計算待測樣品中氨氮的含量，進而計算菌株對氨氮的降解率。篩選出7株菌株5 d內對氨氮的降解率分別為SDB1-1(16.55%)、SDB1-2(39.03%)、SDB1-3(32.32%)、SXT1-1(22.89%)、SXT1-2 (10.92%)、SXT1 (7.05%)、SXT1 (40.07%)。選取SDB1-2為本研究的試驗菌株。

圖2 氨氮(NH4+-N)標準曲線Fig.2 Ammonia nitrogen concentration standard curve

2.3 SDB1-2菌株對不同初始濃度氨氮的去除

如圖3所示，該菌株對高濃度的氨氮適應能力較強，當初始氨氮濃度為100～1 000 mg/L時，其均能對氨氮進行高效去除，在初始氨氮100 mg/L濃度下，24 h后氨氮去除率為100%；當氨氮初始濃度提高到500 mg/L時48 h的去除率為89.02%，72 h的去除率為92.54%；當氨氮初始濃度提高到750 mg/L時，其5 d內最高去除率為82.18%，當初始氨氮濃度高達2 000 mg/L時，仍能對氨氮進行有效去除，5 d內氨氮最高去除率為37.37%。表明該菌株能適應高濃度的氨氮。不同的氨氧化菌對氨氮濃度的耐受程度不同，2006年Kim[9]和Joo[10]的研究均表明，高濃度氨氮會抑制氨氮降解菌及其他細菌的生長，影響氨氧化菌的活性進而影響微生物對氨氮的去除，因此篩選出具有高效氨氮耐受性的菌株對實際應用具有重要的意義。

圖3 氨氮初始濃度對菌株SDB1-2氨氮去除率的影響Fig.3 Effect of the initial concentrate on of NH4+-N on ammonia degradation on rate of strain SDB1-2

2.4 SDB1-2菌株對滲濾液的應用

由圖4可知，把菌株SDB1-2以1%的比例接入原始滲濾液中，5 d對該滲濾液中氨氮的去除率僅為21.13%，把菌株SDB1-2以1%的比例接入到無菌滲濾液中，其對氨氮的去除率顯著提高，5 d對該滲濾液中氨氮的去除率為51.15%；圖4可以看出5 d對該滲濾液中TN的去除率為20.06%，把菌株SDB1-2以1%的比例接入到無菌滲濾液中，其對TN的去除也有所提高，5 d對該滲濾液中總氮的去除率提高到35.03%；圖4顯示菌株SDB1-2對原始滲濾液中的COD去除僅為5.47%，但對無菌滲濾液經過高溫高壓處理后，同等條件下其去除率提高到了57.45%。

圖4 菌株SDB1-2對滲濾液中氨氮和TN以及COD去除率的影響Fig.4 Effect of strain SDB1-2 on ammonia nitrogen，TN，COD removal rate in leachate

3 結論與討論

垃圾滲濾液是一種高濃度的有機廢水，具有水質復雜，微生物種類繁多，有機物、氨氮、TN和COD含量高等特點，單一的處理工藝很難使處理后的滲濾液達到直接排放的標準，生化聯(lián)合物化的方法是目前垃圾滲濾液處理研究的熱點。本文作者在高濃度的初始氨氮濃度條件下從北京市南宮堆肥廠垃圾滲濾液中篩選出一株能高效降解氨氮的菌株SDB1-2，該菌株最高能耐受初始氨氮濃度為2 000 mg/L的人造廢水，在不添加任何其他物質的條件下，該菌株對實際垃圾滲濾液中氨氮、TN和COD均能實現(xiàn)一定程度的降解，對同一批滲濾液進行高溫高壓處理后，同等條件下其對滲濾液中氨氮、TN和COD的降解顯著提高。一是垃圾滲濾液中成分復雜，有機物含量高等特性，抑制了菌株的生長，進而影響了其對滲濾液中氨氮、TN和COD的降解效果，經過高溫高壓后其中有機物等成分發(fā)生變化，正是這些變化促進了菌株SDB1-2的生長，以及其對滲濾液中污染物的去除。二是垃圾滲濾液除了含有氨氮、COD，有機物等，其中的微生物種類和含量也很豐富，蘇月[11]等對北京市大屯垃圾轉運站垃圾壓縮原液中細菌、真菌和古菌的群落結構進行分析，結果表明，細菌包括22個門，357個屬，真菌包括4個門，67個屬，古菌有3個門，35個屬；吳雙[12]等對北京市北神樹生活垃圾填埋場細菌群落結構和分布進了分析表明，其中2-15年的垃圾，細菌群落種類多樣，但是降解功能豐富的菌群豐度較低。這些種類繁多的微生物菌群，在一定程度上抑制了菌株SDB1-2的生長，當對垃圾滲濾液進行高溫高壓滅菌后，其中微生物群落滅亡，反而促進了菌株SDB1-2的生長，進而促進了菌株SDB1-2對滲濾液中污染物的去除。其真正的原理還有待進一步的研究。