（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室國家林業(yè)和草原局中南速生材繁育重點實驗室，南寧 530002）

江南油杉（Keteleeria fortuneivar.cyclolepis）屬松科（Pinaceae）油杉屬，為我國特有常綠喬木，是山地造林、用材林和園林綠化的理想樹種?，F(xiàn)塊狀分布或散生于江西、湖南、廣東、廣西、貴州、云南、福建、浙江等地，常在海拔1 km 以下的丘陵和低山的陽坡地帶生長良好[1]。每年1—2月江南油杉在多年生枝條上形成花芽，3月初花粉發(fā)育成熟并開始散粉，花粉具2個氣囊，風(fēng)媒傳粉[2]。

花粉活力對植物果實的授粉和受精、種子產(chǎn)量和質(zhì)量有直接影響，主要受植物自身遺傳特性與外界因素的影響，尤其易受溫度影響[3-5]。研究花粉的離體萌發(fā)特性，確定最佳培養(yǎng)基組分，可以揭示花粉的生殖細胞和營養(yǎng)細胞發(fā)育及花粉管的生長過程，對于植物雜交育種也具有重要的現(xiàn)實意義[6-8]。近年來的野外觀察發(fā)現(xiàn)，江南油杉在傳粉時極易受雨季影響，致使大量球果授粉不足，進而導(dǎo)致種子敗育率高、質(zhì)量較低。本研究通過花粉離體萌發(fā)對江南油杉的花粉萌發(fā)特性進行研究，對其花粉活力進行快速檢測，并了解其花粉管生長發(fā)育過程，旨在找出適合江南油杉花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基配方，為解決球果授粉不足問題及開展種質(zhì)資源保存與人工授粉提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為裸子植物孢粉學(xué)研究積累有用的資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所需的江南油杉花粉采自廣西南丹縣里湖鄉(xiāng)麻風(fēng)寨（107°28'E，25°07'N）保存良好的天然林。于2018年3月初，采集發(fā)育正常尚未散粉的江南油杉雄球花，帶回實驗室后用鑷子剝下小孢子葉球，放入鋪有硫酸紙的培養(yǎng)皿中，置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)散粉24 h，后收集花粉，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉的離體萌發(fā)

采用液體培養(yǎng)法對江南油杉花粉進行離體萌發(fā)試驗，通過單因素試驗設(shè)計分別對培養(yǎng)基蔗糖濃度、硼酸（H3BO3）濃度、氯化鈣（CaCl2）濃度、pH 值以及培養(yǎng)溫度進行研究。其中，蔗糖濃度試驗的培養(yǎng)基為150 mg/L H3BO3+ 150 mg/L CaCl2+ pH 6.5，并分別添加0、50、100、150、200、250、300、350和400 g/L 蔗糖，共9個處理。H3BO3濃度試驗的培養(yǎng)基為最適蔗糖濃度+150 mg/L CaCl2+ pH 6.5，并分別 添 加0、50、100、150、200、250和300 mg/L H3BO3，共7個處理。CaCl2濃度試驗的培養(yǎng)基為最適蔗糖濃度+最適H3BO3濃度+ pH 6.5，并分別添加0、50、100、150、200、250和300 mg/L CaCl2，共7個處理。pH 值試驗的培養(yǎng)基為最適蔗糖濃度+最適H3BO3濃度+最適CaCl2濃度，pH 值分別設(shè)置為5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，共5個處理。培養(yǎng)基試驗均在25℃條件下100 r/min 振蕩光照培養(yǎng)。以篩選獲得的最佳組分配制培養(yǎng)基，分別設(shè)置15、20、25、30和35℃培養(yǎng)溫度，共5個處理，100 r/min 振蕩光照培養(yǎng)。所有試驗總計33個處理，每處理稱取5 mg 江南油杉花粉置于1 mL 培養(yǎng)基中，重復(fù)3次。

1.2.2 花粉萌發(fā)率與花粉管長度觀測

江南油杉花粉在吸水24 h 后才能逐漸萌發(fā)，因此，各處理分別培養(yǎng)48、72和96 h后從培養(yǎng)基取樣，在OlympusCX-41 型光學(xué)顯微鏡下觀測記錄，每處理的每個重復(fù)隨機觀察5個視野，計算花粉萌發(fā)率，花粉管長度大于花粉粒體寬視為萌發(fā)。花粉萌發(fā)率=(萌發(fā)花粉數(shù)/花粉?？倲?shù)）× 100%。隨機選取萌發(fā)的花粉測量花粉管長度，每處理的每個重復(fù)隨機測量30個花粉管長度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016對花粉萌發(fā)率和花粉管長度進行常規(guī)統(tǒng)計和制圖。采用SPSS 19.0對各試驗處理間花粉萌發(fā)率和花粉管長度進行方差分析和多重比較（鄧肯氏新復(fù)極差法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖濃度對花粉離體萌發(fā)的影響

不同蔗糖濃度處理，江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長度存在極顯著差異（P＜0.01）。在無蔗糖的培養(yǎng)基（0 g/L）中，雖然花粉也可萌發(fā)，但萌發(fā)率顯著低于100～300 g/L 濃度下花粉的萌發(fā)率（P＜0.05），花粉管長度顯著低于50～300 g/L 濃度下花粉管長度（P＜0.05）（表1）。3個時段，花粉萌發(fā)率和花粉管長度均隨蔗糖濃度的增加呈先增加后減小的趨勢；培養(yǎng)48 h，花粉萌發(fā)率在250 g/L 濃度下達到最大（17.5%），花粉管長度在200 g/L 濃度下最長（89.4 μm）；培養(yǎng)72和96 h，花粉萌發(fā)率和花粉管長度均在250 g/L 濃度下達到最大，分別為24.4%、141.3 μm和32.2%、210.8 μm。250 g/L 蔗糖較適合江南油杉花粉萌發(fā)。

2.2 H3BO3濃度對花粉離體萌發(fā)的影響

不同H3BO3濃度處理，江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長度存在極顯著差異（P＜0.01）。3個時段，花粉萌發(fā)率和花粉管長度均隨H3BO3濃度的增加呈先增加后減小的趨勢；培養(yǎng)48 h，花粉萌發(fā)率和花粉管長度均在200 mg/L 濃度下達到高峰，分別為14.8%和82.9 μm；培養(yǎng)72和96 h，花粉萌發(fā)率均在200 mg/L 濃度下達到高峰，分別為26.8%和36.1%，花粉管長度均在250 mg/L 濃度下達到高峰，分別為150.4和218.4 μm，但與200 mg/L 濃度下花粉管長度差異不顯著（表2）。200 mg/L H3BO3較適合江南油杉花粉萌發(fā)。

表1 蔗糖濃度對江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響Tab.1 Effects of sucrose concentrations on pollen germination rate and pollen tube length of Keteleeria fortunei var.cyclolepis

表2 H3BO3濃度對江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響Tab.2 Effects of H3BO3 concentrations on pollen germination rate and pollen tube length of Keteleeria fortunei var.cyclolepis

2.3 CaCl2濃度對花粉離體萌發(fā)的影響

3個時段，江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長度均隨CaCl2濃度的增加呈先增加后減小的趨勢；培養(yǎng)48 h，花粉萌發(fā)率和花粉管長度均在100 mg/L濃度下達到高峰，分別為18.7%和81.9 μm；培養(yǎng)72和96 h，花粉萌發(fā)率均在100 mg/L 濃度下達到高峰，分別為32.3%和41.3%，花粉管長度均在150 mg/L濃度達到高峰，分別為151.4和215.3 μm，但與100 mg/L 濃度下花粉管長度差異不顯著（表3）。100 mg/L CaCl2較適合江南油杉花粉萌發(fā)。

表3 CaCl2濃度對江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響Tab.3 Effects of CaCl2 concentrations on pollen germination rate and pollen tube length of Keteleeria fortunei var.cyclolepis

2.4 pH值對花粉離體萌發(fā)的影響

當(dāng)培養(yǎng)基pH 值為5.0和5.5 時，江南油杉花粉萌發(fā)率較低，兩者差異不顯著，花粉管生長緩慢，隨著培養(yǎng)基pH 值升高，花粉萌發(fā)率和花粉管長度也隨之增加；當(dāng)pH 值為6.5 時，3個時段花粉萌發(fā)率和花粉管長度均達到最大，之后降低（表4）。培養(yǎng)基pH 6.5 較適合江南油杉花粉萌發(fā)。

表4 pH值對江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響Tab.4 Effects of pH values on pollen germination rate and pollen tube length of Keteleeria fortunei var.cyclolepis

2.5 溫度對花粉離體萌發(fā)的影響

不同溫度處理下江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長度差異顯著（P＜0.05）。在15℃處理下，花粉萌發(fā)率較低，花粉管生長緩慢；隨著溫度升高，花粉萌發(fā)率迅速升高，3個時段均在25℃最高，分別為18.5%（48 h）、33.2%（72 h）和42.1%（96 h）（圖1a）。3個時段花粉管長度隨溫度的變化規(guī)律不一致；培養(yǎng)48 h，花粉管長度隨溫度升高逐漸增加；培養(yǎng)72 h，花粉管長度隨溫度升高先增加后減小，在30℃達到最大（156.24 μm），但與25℃花粉管長度差異不顯著；培養(yǎng)96 h，花粉管長度隨溫度升高先增加后減小，在25℃達到最大（217.44 μm）（圖1b）。

圖1 溫度對江南油杉花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響Fig.1 Effects of temperatures on pollen germination rate and pollen tube length of Keteleeria fortunei var.cyclolepis

3 結(jié)論與討論

大量研究表明，在花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基中蔗糖、H3BO3和Ca2+為最常用的添加物質(zhì)，其中，蔗糖既是花粉萌發(fā)和花粉管壁合成的營養(yǎng)物質(zhì)來源，又是花粉萌發(fā)時內(nèi)部代謝與跨膜運輸?shù)奶荚?，維持著外界環(huán)境的滲透壓和花粉萌發(fā)形態(tài)[6，9]。Dane 等[10]研究發(fā)現(xiàn)花粉在離體萌發(fā)時，其自身儲存的營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)控著外界的蔗糖濃度。本研究結(jié)果表明，在無蔗糖培養(yǎng)基中江南油杉花粉仍可萌發(fā)，但萌發(fā)率和花粉管長度顯著低于添加蔗糖的培養(yǎng)基，可能是花粉自身儲存的營養(yǎng)物質(zhì)為其萌發(fā)提供一定養(yǎng)分，但隨著營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，花粉管生長緩慢；添加不同濃度蔗糖的培養(yǎng)基之間，花粉萌發(fā)率和花粉管長度差異顯著，高濃度蔗糖會抑制花粉萌發(fā)和花粉管生長，這與田菊等[11]對油松（Pinus tabuliformis）花粉離體萌發(fā)和李國平等[12]對黑松（Pinus thunbergii）花粉離體萌發(fā)的研究結(jié)果一致。

花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基中的H3BO3可引導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)的Ca2+進入花粉細胞內(nèi)，并增加花粉細胞對糖的吸收與代謝，促進花粉萌發(fā)和花粉管生長[13-14]。Ca2+對花粉管極性生長與生長方向具有調(diào)控作用[15]。相關(guān)研究表明，H3BO3濃度和Ca2+濃度對油松[11]、黑松[12]、五針?biāo)桑≒inus parviflora）、羅漢松（Podocarpus macro?phyllus）[16]和銀杏（Ginkgo biloba）[17]等裸子植物離體花粉的萌發(fā)率和花粉管長度均表現(xiàn)出先促進后抑制的作用，高濃度硼酸和Ca2+會抑制花粉的萌發(fā)，與本文研究結(jié)果一致。但本研究中，培養(yǎng)48 h，花粉管長度在200 mg/L H3BO3和100 mg/L CaCl2處理下達到高峰，而培養(yǎng)72和96 h，花粉管長度均在250 mg/L H3BO3和150 mg/L CaCl2處理下達到高峰，這可能是因為在培養(yǎng)前期，200 mg/L H3BO3和100 mg/L CaCl2能滿足花粉管生長的需求，隨著培養(yǎng)時間增加需要更高的H3BO3和CaCl2濃度才能促進花粉管生長。

不同植物花粉離體培養(yǎng)基最佳pH 值和最適培養(yǎng)溫度差異較大。趙麗娟等[6]研究表明小黑楊（Pop?ulus simonii×P.nigra）花粉離體萌發(fā)的最佳pH 值為6.0，最適培養(yǎng)溫度為21℃；黃家興等[18]研究表明凱特杏（Prunus armeniaca‘Katy’）花粉離體萌發(fā)的最佳pH值為6.0，最適培養(yǎng)溫度為20℃；Kakani等[19]研究表明陸地棉（Gossypium hirsutum）花粉離體萌發(fā)的最適溫度為32℃。試驗表明，pH 值和培養(yǎng)溫度均對江南油杉花粉萌發(fā)影響顯著。江南油杉花粉離體培養(yǎng)基最適pH值為6.5，當(dāng)pH值為7.0時，花粉萌發(fā)率下降，當(dāng)pH 值為5.0 時，花粉萌發(fā)率極低，且花粉管生長緩慢，說明江南油杉花粉萌發(fā)需要弱酸環(huán)境，強酸可能會破壞花粉細胞內(nèi)部代謝平衡[20]。江南油杉花粉萌發(fā)的最適溫度為25℃，過高或過低均會抑制其花粉萌發(fā)，25℃與江南油杉散粉期外界溫度相近，說明溫度并不是自然條件下江南油杉球果授粉不足的限制因素。

綜上所述，江南油杉花粉離體萌發(fā)最佳培養(yǎng)基組合和培養(yǎng)條件為250 g/L 蔗糖+ 200 mg/L H3BO3+100 mg/L CaCl2，pH值為6.5，置于25℃光照培養(yǎng)96 h時萌發(fā)率為42.4%，為進一步開展江南油杉種質(zhì)資源保存和人工授粉的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。