劉 佳，曹得萍，張雪飛，馬俊英，馬 霄，王永順，雷 雯，王 威，詹培珍，張 震

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.青海省地方病預(yù)防控制所，青海 西寧 811602；3.青海省包蟲病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810001)

包蟲病目前的診斷方式主要為超聲學(xué)檢查，輔助診斷方式為血清學(xué)檢測(cè)。但超聲檢查對(duì)于操作人員的專業(yè)技術(shù)要求較高，而血清學(xué)檢測(cè)方法又存在靈敏度和特異性問題。因此，尋找高靈敏度的早期泡型包蟲病診斷生物學(xué)標(biāo)志物十分必要。本研究采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)泡型包蟲病患者和健康者血清miRNA進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)差異表達(dá)miRNA調(diào)控的靶基因進(jìn)行初步預(yù)測(cè)和功能及通路富集性分析。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集青海大學(xué)附屬醫(yī)院泡型包蟲病患者血清樣本3例，其中，男性1例，女性 2例，平均年齡為40.33±2.05歲。采集血清前患者均未行任何治療。5例健康對(duì)照血清樣本來自青海大學(xué)附屬醫(yī)院體檢健康者，其中男性2例，女性3例，平均年齡為40±3.56歲。本研究已獲得青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 血清標(biāo)本處理

在泡型包蟲病患者治療前和健康者體檢時(shí)用一次性真空采血管采集空腹外周靜脈血 5 mL離心(2000r/min)8 min，提取血清。

1.2.2 血清miRNA的提取

使用Trizol(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)提取8份血清總RNA。使用超微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop ND-2000，美國(guó)Thermo Scientific公司)對(duì)提取后的樣品總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，RNA的純度以O(shè)D260/OD280值在1.8～2.0之間為合格。將質(zhì)檢合格的樣品送至杭州聯(lián)川生物科技股份有限公司進(jìn)行miRNA高通量測(cè)序。

1.2.3 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)處理

小RNA文庫(kù)制備采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits(Illumina，San Diego，USA)試劑盒。文庫(kù)制備工作完成后，對(duì)構(gòu)建好的文庫(kù)使用高通量測(cè)序儀(Illumina Hiseq2500)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)使用ACGT101-miR(LC Sciences，Houston，Texas，USA)軟件進(jìn)行處理。

1.2.4 差異表達(dá)miRNA的篩選

對(duì)差異表達(dá)基因的篩選以|log2(Foldchange)|>1(即兩倍差異倍數(shù))且P-value≤0.05為閾值。數(shù)據(jù)分析應(yīng)用ACGT101-miR(LC Sciences，Houston，Texas，USA)及SPSS18.0(IBM，USA)軟件進(jìn)行。

1.2.5 靶基因的預(yù)測(cè)及功能與通路富集性分析

使用TargetScan[1-3]、miRanda[4-6]兩款軟件對(duì)顯著性差異的miRNA分別進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，最后取此兩款軟件的交集作為差異miRNA靶基因。對(duì)靶基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG Pathway功能注釋。應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行GO和KEGG pathway差異表達(dá)富集分析，以P-value≤0.05為閾值，滿足此條件視作靶基因顯著富集。

2 結(jié)果

2.1 小RNA長(zhǎng)度分布

對(duì)高通量測(cè)序所得的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)，顯示大部分?jǐn)?shù)據(jù)分布在18～26 nt，符合Dicer 酶切割的典型特征，見圖1。

2.2 差異miRNA表達(dá)分析

泡型包蟲病患者與健康者血清中差異表達(dá)的miRNA共有9個(gè)(|log2(Foldchange)|≥1，P-value≤0.05)。其中上調(diào)表達(dá)的有1個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有8個(gè)，見表1。

2.3 差異表達(dá)miRNA火山圖分析

通過繪制火山圖以了解差異表達(dá)miRNA的整體分布情況，見圖2。其中橫坐標(biāo)代表miRNA在不同樣本中差異表達(dá)倍數(shù)變化，縱坐標(biāo)代表miRNA表達(dá)量變化差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；紅色代表上調(diào)的顯著差異表達(dá)基因，藍(lán)色代表下調(diào)的顯著差異表達(dá)基因，灰色代表非顯著性差異表達(dá)基因。

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

使用TargetScan、miRanda兩款軟件對(duì)有顯著性差異的miRNA分別進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，最后取此兩款軟件的交集作為差異miRNA的最終靶基因。GO功能富集分析結(jié)果表明，這些靶基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生化過程，蛋白結(jié)合、金屬離子結(jié)合等分子功能的調(diào)節(jié)，以及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器等的構(gòu)成及細(xì)胞膜的調(diào)節(jié)。將這些靶基因?qū)?yīng)的GO注釋功能按照參與的生化過程、細(xì)胞成分和分子功能分為三類，并且將每一類中的GO功能按照注釋到的靶基因個(gè)數(shù)從高到低排序并做圖，橫坐標(biāo)是GO功能注釋分類，縱坐標(biāo)是靶基因所占百分比，見圖3。

圖1小RNA長(zhǎng)度分布圖

Figure1Length distribution of small RNA

表1泡型包蟲病患者與健康者血清差異表達(dá)miRNA

Table 1Serum miRNAs differential expression between patients with alveolarechinococcosis and healthy

圖2差異表達(dá)miRNA火山圖

Figure2volcano of deferentially expressed miRNAs

圖3 GO富集性柱狀圖

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，這些由差異性miRNA調(diào)節(jié)的靶基因主要參與MAPK信號(hào)途徑、鈣離子信號(hào)途徑、mTOR信號(hào)途徑等信號(hào)通路。此外，這些靶基因在黏著斑連接、膽堿代謝及細(xì)胞吞噬等功能中富集程度較大。將KEGG通路富集分析結(jié)果以散點(diǎn)圖展示：富集系數(shù)(Rich Factor)表示位于該KEGG的差異基因數(shù)/位于該KEGG的總基因數(shù)，Rich Factor值越大，KEGG富集程度越大，見圖4。圖5、6分別是靶基因參與的MAPK信號(hào)途徑與鈣離子信號(hào)途徑的KEGG信號(hào)通路分析圖。其中紅色方框?yàn)楸磉_(dá)差異miRNA調(diào)控的靶基因。

圖4KEGG富集性散點(diǎn)圖

Figure4KEGG enrichment scatterplot

圖5 MAPK信號(hào)通路分析圖

圖6 鈣離子信號(hào)通路分析圖

3 討論

miRNA是真核生物中一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼RNA，其長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸。miRNA通過抑制或降解與其相對(duì)應(yīng)的靶基因的翻譯功能，從而參與疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等的各個(gè)階段[7]。此外，在疾病的每個(gè)階段除有與miRNA相對(duì)應(yīng)的靶基因發(fā)生改變外，也有調(diào)控這些靶基因的miRNA發(fā)生變化[8-9]。有文獻(xiàn)也認(rèn)為，在寄生蟲病中，宿主miRNA的表達(dá)譜通常會(huì)在感染寄生蟲后發(fā)生改變[10]。目前有關(guān)泡型包蟲病患者血清特異性miRNA的研究罕有報(bào)道，故本研究以泡型包蟲病患者血清中miRNA的表達(dá)差異情況作為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行初步研究分析。

本次研究使用高通量測(cè)序方法檢測(cè)了泡型包蟲病患者與健康者血清中miRNA的表達(dá)情況，其中有9個(gè)血清miRNA呈差異表達(dá)，提示泡型包蟲病患者血清和健康者血清miRNA的表達(dá)具有差異性。產(chǎn)生這種差異性的原因可能為：一是由于宿主自身組織細(xì)胞中的miRNA因?yàn)楦腥炯纳x而發(fā)生改變，進(jìn)而影響血清中miRNA的表達(dá)量；二是由于寄生蟲在感染宿主后，可以將其自身miRNA釋放至宿主血液中，進(jìn)而導(dǎo)致宿主血清miRNA改變[11]。

本研究通過對(duì)有差異性miRNA調(diào)控的靶基因進(jìn)行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，這些靶基因參與的主要功能中，蛋白結(jié)合功能與寄生蟲病發(fā)生密切相關(guān)。研究顯示，寄生蟲代謝產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)可作用于宿主并與寄生蟲的侵襲有關(guān)[12]。另有研究表明，寄生蟲可通過攝取宿主體內(nèi)的蛋白質(zhì)來減輕發(fā)生在宿主體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，從而建立長(zhǎng)期感染[13]。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，差異性miRNA調(diào)控的靶基因主要參與的通路為MAPK信號(hào)途徑與鈣離子信號(hào)途徑。MAPK信號(hào)途徑是在肝臟的纖維化發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮著重要作用的途徑[14]，鈣信號(hào)途徑中發(fā)揮重要作用的Ca2+信號(hào)蛋白在寄生蟲病的免疫調(diào)控機(jī)制中起關(guān)鍵作用[15]，而泡型包蟲病的主要發(fā)病部位為肝臟，其病理表現(xiàn)為泡球蚴寄生部位的組織常發(fā)生壞死、周圍因存在淋巴細(xì)胞和其他組織細(xì)胞的浸潤(rùn)而伴有慢性炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致周圍組織的纖維化和鈣化。

綜上所述，本研究表明，泡型包蟲病患者血清miRNA的表達(dá)具有差異性。經(jīng)本研究篩選出的泡型包蟲病患者血清差異表達(dá)的miRNA可能能夠作為泡型包蟲病早期診斷的新的生物標(biāo)志物。GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果提示血清差異性miRNA調(diào)控的靶基因與泡型包蟲病的免疫應(yīng)答及病理改變密切相關(guān)，但其關(guān)聯(lián)性仍需進(jìn)一步明確。本研究雖獲得了一些與泡型包蟲病相關(guān)的有意義結(jié)果，但研究樣本數(shù)量小，血清miRNA差異表達(dá)譜及靶基因功能僅作為初步分析，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本對(duì)相關(guān)結(jié)果加以驗(yàn)證并進(jìn)行深入探究。