彭立影，劉功良*，許瑩瑩，余潔瑜，白衛(wèi)東*，賈愛(ài)娟，何松貴

1(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州，510225) 2(廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東 中山，528437)3(廣東省九江酒廠有限公司，廣東 佛山，528203)

黃酒，是用糯米、黍米等為原料，加入酒曲、酒母等糖化發(fā)酵劑釀制而成的一種發(fā)酵酒，與啤酒、葡萄酒并稱(chēng)為世界三大古酒[1-3]。黃酒富含多種氨基酸、微量元素、有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4-6]，有抗衰老、降血壓、降膽固醇和免疫調(diào)節(jié)等作用[7-10]。我國(guó)傳統(tǒng)的黃酒主要以甜型和半甜型為主，隨著人們保健意識(shí)的提高，低糖型黃酒的開(kāi)發(fā)成為相關(guān)研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)。酵母菌在黃酒釀造過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，傳統(tǒng)釀造的客家黃酒糖化程度高，過(guò)高的糖度抑制酵母的生長(zhǎng)繁殖，從而抑制酒精度的提高?？鼓嫘阅軆?yōu)良的酵母菌能夠提升黃酒的品質(zhì)，具有很大的研究?jī)r(jià)值[11-12]。

楊魯君[13]利用高糖環(huán)境(40%糖濃度的培養(yǎng)基)從發(fā)酵醪液中篩選到優(yōu)良菌株F-18，該菌株在產(chǎn)酒精量上和工廠菌株相差不多，產(chǎn)酒率高于工廠菌株，且總酸、氨態(tài)氮和非糖固形物也高于工廠菌株，但總糖含量與工廠菌株基本上相差不多。夏艷秋等[14]對(duì)原始菌株YS分別采用乙醇-熱沖擊法、細(xì)胞紫外誘變法和原生質(zhì)體紫外誘變法，結(jié)合高溫馴育進(jìn)行選育，篩選到1株在38 ℃能正常生長(zhǎng)發(fā)酵的黃酒酵母突變株YS6.2.5，該菌株在30 ℃時(shí)產(chǎn)酒精能力、酒精耐性、高糖耐性分別為9.0%、19%、30 °Bx，38 ℃時(shí)相應(yīng)指標(biāo)分別為6.5%、20%、28 °Bx。謝廣發(fā)等[15]采用TTC法、CO2失重法及釀酒試驗(yàn)，篩選出菌種GY-9，并把該菌種投入到黃酒生產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)該菌種能縮短發(fā)酵周期，提高黃酒的酒精度。

本研究在黃酒生產(chǎn)過(guò)程中添加蜂蜜接合酵母LGL-1，該菌株能更好地在高糖環(huán)境下發(fā)酵產(chǎn)酒精，可提高酒精發(fā)酵的效率。將該酵母應(yīng)用于廣東黃酒釀造中，可得到糖度低、酒精度高、口味醇厚的黃酒。為確定酵母的最佳添加量、添加時(shí)間以及水添加量和前發(fā)酵時(shí)間，借助Design-Expert軟件設(shè)計(jì)中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)組合設(shè)計(jì)法(central composite design，CCD)設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期提高設(shè)備利用率及經(jīng)濟(jì)效益，為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酒曲、麥曲、紅曲：河源黃龍紫金酒業(yè)有限公司提供；白糯米：市售；麥芽汁培養(yǎng)基：廣東凱瑞微生物科技有限公司；蜂蜜接合酵母LGL-1：仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室篩選出的耐高糖酵母菌株。

HZQ-C空氣浴振蕩器，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；JJ600精密電子天平，常熟雙杰測(cè)試儀器廠；722-G紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；DHP-9602恒溫培養(yǎng)箱，上海-恒科學(xué)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；酒精比重計(jì)(0～50%)，余姚市方橋試驗(yàn)儀表廠。

1.2 方法

1.2.1 黃酒釀造的工藝流程[16-18]

1.2.2 蜂蜜接合酵母LGL-1生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

從低溫保藏酵母中挑取兩環(huán)接種于70 °Bé麥芽汁培養(yǎng)基的試管中，在28 ℃、170 r/min的搖床中培養(yǎng)2 d，然后將蜂蜜接合酵母LGL-1全部轉(zhuǎn)移到相同培養(yǎng)基的錐形瓶中于相同環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)。

采用比濁法對(duì)酵母菌生長(zhǎng)曲線進(jìn)行測(cè)定。每隔6 h取2 mL菌懸液，將比色皿置于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)560 nm處測(cè)量OD值，對(duì)照組為不加酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基。以酵母菌培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，酵母菌懸菌液OD值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 理化指標(biāo)測(cè)定

總糖、酒精度：均參照GB/T 13662—2018《黃酒》[1]國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的方法測(cè)定。

1.2.4 影響黃酒發(fā)酵工藝的單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 酵母添加量對(duì)廣東黃酒發(fā)酵的影響

固定酵母添加時(shí)間(即添加酵母時(shí)黃酒發(fā)酵的時(shí)間)為48 h，前發(fā)酵時(shí)間為7 d，不加水，100 g干米中分別添加酵母0、2、3、4、5、7、9 mL。以糖度和酒精度為指標(biāo)考察酵母添加量對(duì)黃酒的影響。

1.2.4.2 酵母添加時(shí)間對(duì)廣東黃酒發(fā)酵的影響

固定酵母添加量為4 mL，前發(fā)酵時(shí)間為7 d，不加水，分別選取酵母添加時(shí)間為42、48、54、60、66、72 h。 以糖度和酒精度為指標(biāo)考察酵母添加時(shí)間對(duì)黃酒的影響。

1.2.4.3 水添加量對(duì)廣東黃酒發(fā)酵的影響

固定酵母添加量為4 mL，酵母添加時(shí)間為54 h，前發(fā)酵時(shí)間為7 d，分別選取加水量為干米總質(zhì)量的0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%。以糖度和酒精度為指標(biāo)考察水添加量對(duì)黃酒的影響。

1.2.4.4 前發(fā)酵時(shí)間對(duì)廣東黃酒的影響

固定酵母添加量為4 mL，酵母添加時(shí)間為54 h，加水量為70%，分別選取前發(fā)酵時(shí)間為6、7、8、9、10、11、12 d。以糖度和酒精度為指標(biāo)考察前發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃酒的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化黃酒發(fā)酵工藝

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，借助Design-Expert軟件，采用中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取酵母添加量(A)、酵母添加時(shí)間(B)、水添加量(C)和前發(fā)酵時(shí)間(D)為響應(yīng)面優(yōu)化的考察量，以酒精度(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)黃酒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂蜜接合酵母LGL-1生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

由圖1可知，在培養(yǎng)基糖度為700 g/L時(shí)，0～20 h 是蜂蜜接合酵母LGL-1的遲滯期，酵母數(shù)量增長(zhǎng)緩慢，20 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，50 h后基本進(jìn)入穩(wěn)定期，該酵母遲滯期相對(duì)較短，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期較長(zhǎng)，運(yùn)用于實(shí)際生產(chǎn)中可節(jié)約一定的成本。綜上所述，選擇50 h作為蜂蜜接合酵母LGL-1的最佳培養(yǎng)時(shí)間，即蜂蜜接合酵母LGL-1培養(yǎng)50 h后加入黃酒中發(fā)酵。

圖1 蜂蜜接合酵母LGL-1的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Zygosacharomyces mellis LGL-1

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 酵母添加量對(duì)廣東黃酒的影響

圖2 酵母添加量對(duì)廣東黃酒糖度和酒精度的影響Fig.2 Effect of the Zygosacharomyces mellis LGL-1 addition on the sugar content and alcohol content of yellow rice wine

圖2是酵母添加量與黃酒糖度和酒精度的關(guān)系曲線圖。由圖可知，當(dāng)酵母添加量低于5 mL時(shí)，隨著酵母添加量的增加，黃酒含糖質(zhì)量濃度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；當(dāng)酵母添加量增加到5 mL時(shí)，黃酒含糖質(zhì)量濃度達(dá)最低值；當(dāng)酵母添加量高于5 mL時(shí)，隨著酵母添加量的增加，黃酒含糖質(zhì)量濃度升高。當(dāng)酵母添加量低于4 mL時(shí)，隨著酵母添加量的增加，黃酒酒精度不斷增加；當(dāng)酵母添加量為4 mL時(shí)，黃酒酒精度達(dá)到最大值，此時(shí)黃酒的含糖質(zhì)量濃度為313.9 g/L，酒精度為8%vol；當(dāng)酵母添加量高于4 mL時(shí)，酵母添加量增加，黃酒酒精度下降。推測(cè)可能前期酵母菌由于營(yíng)養(yǎng)充足而快速生長(zhǎng)繁殖，到后期發(fā)酵體系營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，酵母菌無(wú)氧呼吸作用被抑制導(dǎo)致生成酒精減少，且發(fā)酵過(guò)程中部分乙醇被代謝生成乙酸參與乙酯類(lèi)化合物的形成，導(dǎo)致酒精濃度降低[19]。因此，確定酵母的最優(yōu)添加量為4 mL。

2.2.2 酵母添加時(shí)間對(duì)廣東黃酒的影響

圖3是酵母添加時(shí)間與黃酒糖度和酒精度的關(guān)系曲線圖。由圖3可知，糖化42～54 h，隨著酵母添加時(shí)間越晚，黃酒含糖質(zhì)量濃度呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。當(dāng)糖化至54 h 時(shí)，黃酒含糖質(zhì)量濃度達(dá)到最低值。糖化54～72 h， 酵母添加時(shí)間越晚，黃酒含糖質(zhì)量濃度越高。從圖中可知，糖化42～66 h，黃酒酒精度在8%vol附近波動(dòng)，變化不大。此結(jié)果與崔闖等[20]研究糖化時(shí)間對(duì)小米黃酒糖度的影響一致。因此，選擇酵母的最佳添加時(shí)間為54 h。

圖3 酵母添加時(shí)間對(duì)廣東黃酒糖度和酒精度的影響Fig.3 Effect of the Zygosacharomyces mellis LGL-1 adding time on the sugar content and alcohol content of yellow rice wine

2.2.3 水添加量對(duì)廣東黃酒的影響

圖4是水添加量對(duì)黃酒糖度和酒精度的關(guān)系曲線圖。由圖4可知，前發(fā)酵7 d，隨著水添加量的增加，黃酒含糖質(zhì)量濃度降低，且下降趨勢(shì)接近于線性關(guān)系，黃酒酒精度呈緩慢上升趨勢(shì)。高糖度會(huì)抑制酵母菌的生長(zhǎng)，引起細(xì)胞內(nèi)水分活度和細(xì)胞質(zhì)組成發(fā)生顯著變化，酵母菌的細(xì)胞膜及菌體內(nèi)的酶受到破壞，不利于將糖分轉(zhuǎn)化成酒精。在糖化后加入一定的無(wú)菌水，可減少高滲透壓對(duì)酵母菌的抑制作用，提高出酒率[21]。賴(lài)櫻花等[22]研究水添加量對(duì)黃酒質(zhì)量的影響，分析得到隨著水添加量的增加，黃酒糖度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，選擇70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為最佳的水添加量，此時(shí)黃酒含糖質(zhì)量濃度達(dá)到最低值104.3 g/L，酒精濃度達(dá)到最高值11%vol。

圖4 水添加量對(duì)廣東黃酒糖度和酒精度的影響Fig.4 Effect of the water’s additionon the sugar content and alcohol content of yellow rice wine

2.2.4 前發(fā)酵時(shí)間對(duì)廣東黃酒的影響

圖5是前發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃酒糖度和酒精度的關(guān)系曲線圖。由圖5可知，隨著前發(fā)酵時(shí)間的增加，黃酒含糖質(zhì)量濃度不斷降低，直至第8天后，黃酒含糖質(zhì)量濃度下降趨勢(shì)較平緩。

圖5 前發(fā)酵時(shí)間對(duì)廣東黃酒糖度和酒精度的影響Fig.5 Effect of the pre-fermentaition time on the sugar content and alcohol content of yellow rice wine

前發(fā)酵過(guò)程中，黃酒酒精度不斷上升，到第8天時(shí)，酒精度上升緩慢趨于平緩。徐艷等[23]研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃酒的影響，分析得到黃酒在10～25 d，總糖的產(chǎn)生量隨著時(shí)間的增加而減少，然后趨于穩(wěn)定；酒精度在發(fā)酵時(shí)間為10～25 d呈線性增加趨勢(shì)，25 d后有所下降。因此，確定最佳的前發(fā)酵時(shí)間為8 d。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝試驗(yàn)結(jié)果與分析

按CCD中心復(fù)合試驗(yàn)方案進(jìn)行4因素3水平試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到酵母添加量(A)、酵母添加時(shí)間(B)、水添加量(C)、前發(fā)酵時(shí)間(D)的回歸模型方程為：

Y=10.78+0.5A-0.1B+0.97C+0.3D+0.31AB+0.24AC-0.21AD-0.038BC+0.31BD-0.012CD-0.097A2-0.50B2+0.1C2-0.3D2

采用Design Expert軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)黃酒發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，回歸模型具有顯著性(P<0.05)，失擬差不顯著(P=0.126 9>0.05)，說(shuō)明廣東黃酒酒精度模型和實(shí)際情況擬合度較好，因此可用該數(shù)學(xué)模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。4個(gè)因素對(duì)酒精度的影響大小依次為C(水添加量)>A(酵母添加量)>D(前發(fā)酵時(shí)間)>B(酵母添加時(shí)間)。從表3可知，AB、AC、AD和BD的相互作用具有顯著性，其響應(yīng)面曲面圖見(jiàn)圖6。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

注：*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；#，差異不顯著(P>0.05)。

a-酵母添加量與添加時(shí)間；b-酵母添加量與水添加量;c-酵母添加量與前發(fā)酵時(shí)間;d-酵母添加時(shí)間與前發(fā)酵時(shí)間圖6 各因素交互作用的響應(yīng)曲面和等高線Fig.6 Diagrams of response surface and contour of the interactions between each factor

由圖6可直觀反映出酵母添加量(A)、酵母添加時(shí)間(B)、水添加量(C)和前發(fā)酵時(shí)間(D)之間交互作用對(duì)廣東黃酒酒精度的影響。當(dāng)?shù)雀呔€呈圓形時(shí)表示兩因素交互作用不顯著，呈橢圓形或馬鞍形時(shí)表示兩因素交互作用顯著[24-25]。圖6中的等高線均成明顯的橢圓形，說(shuō)明AB、AC、AD以及BD相互作用對(duì)廣東黃酒酒精度有顯著影響(P<0.05)。

2.4 黃酒發(fā)酵工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果及分析

通過(guò)響應(yīng)面法得到廣東黃酒發(fā)酵最優(yōu)工藝條件：酵母添加量4 mL、酵母添加時(shí)間54 h、水添加量70%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、前發(fā)酵時(shí)間8 d。根據(jù)所建立的數(shù)學(xué)模型，可得到最大響應(yīng)值時(shí)的15個(gè)最優(yōu)條件。將這15個(gè)試驗(yàn)條件和正交實(shí)驗(yàn)中最佳結(jié)果的試驗(yàn)條件(試驗(yàn)17)一起組成驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以得到廣東黃酒的最佳工藝條件。驗(yàn)證試驗(yàn)條件和結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)條件和結(jié)果Table 4 The conditions and results of validation test

由表4可知，試驗(yàn)3的黃酒酒精度最高，該條件下，黃酒酒精度為11.7%vol。因此，確定黃酒的最佳釀造工藝條件為：酵母添加量4 mL、酵母添加時(shí)間50 h、 水添加量78%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、前發(fā)酵時(shí)間8.4 d，該條件下，含糖質(zhì)量濃度為95.6 g/L，酒精度為11.7%vol。

3 結(jié)論

本研究首先通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考察酵母添加量、酵母添加時(shí)間、水添加量和前發(fā)酵時(shí)間對(duì)廣東黃酒糖度和酒精度的影響，在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)廣東黃酒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到較優(yōu)的發(fā)酵工藝條件，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最后得到廣東黃酒的最佳發(fā)酵工藝條件：酵母添加量4 mL(100 g干米中)、酵母添加時(shí)間50 h、水添加量78%、前發(fā)酵時(shí)間8.4 d，此條件下得到的黃酒含糖質(zhì)量濃度和酒精度分別為95.6 g/L和11.7%vol。可見(jiàn)，以蜂蜜接合酵母LGL-1協(xié)同傳統(tǒng)曲種發(fā)酵廣東黃酒為低糖型黃酒的開(kāi)發(fā)提供了一定的理論依據(jù)及技術(shù)支持。