李 君，曹立瀛，侯金友，張 慧，鄒紅蕊，孫 超，崔振超

(1.開灤總醫(yī)院輸血科，河北唐山 063000；2.唐山市中心血站，河北唐山 063000； 3.秦皇島市中心血站，河北秦皇島 066000)

ABO血型系統(tǒng)在臨床輸血中占有極其重要的地位，血型鑒定是保障輸血安全的必要前提[1]，但實際工作中經(jīng)常遇到正反定型不相符致血型鑒定困難的病例，亞型是導(dǎo)致正反定型不符的常見原因之一，其中以A2/A2B最常見。研究顯示一定比例的A2或A2B個體血清中含有抗-A1抗體，且A2B個體檢出抗-A1抗體的比例高于A2個體[2-3]，當(dāng)A2B型受血者血清中存在37℃條件下反應(yīng)的抗-A1抗體時，輸入AB型血液可能導(dǎo)致溶血性輸血反應(yīng)或輸注無效。但目前我國沒有要求常規(guī)檢測A2抗原，輸血前試驗存在漏檢的可能。因此開展A2B亞型檢測能提升輸血安全性，有效減少溶血性輸血反應(yīng)[3-4]。本文通過研究河北省唐山地區(qū)人群A2B亞型的分布情況及分子機制，從而探討輸血前開展A2B亞型檢測的臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2017年11月～2018年3月在本院進(jìn)行血型檢測的所有住院、門診、急診患者及體檢人員，選擇血型為AB表型的人群進(jìn)行研究。采集患者或體檢人員EDTA抗凝血標(biāo)本各2管，1管進(jìn)行血清學(xué)試驗，1管進(jìn)行ABO基因擴增及測序。

1.2 試劑與設(shè)備 單克隆抗-A、抗-B試劑、抗-H試劑、抗-A1試劑購自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司；抗-AB購自法國Diagast公司；反定型試劑細(xì)胞、抗篩細(xì)胞、ABO，RhD血型定型檢測卡、抗人球蛋白檢測卡購自長春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司，所有試劑均在有效期內(nèi)使用。BASO血庫專用離心機、TD-3A離心機、FYQ免疫微柱孵育器。

1.3 方法

1.3.1 血清學(xué)檢測：微柱凝膠卡式法檢測ABO，RhD血型按照試劑說明書進(jìn)行操作。微柱凝膠卡式法ABO正反定型為AB型的標(biāo)本，采用試管法抗-A1和抗-H試劑初篩。與抗-A1反應(yīng)陰性，再次復(fù)核ABO正反定型試驗；其中正定型與抗-A、抗-B、抗-A1、抗-AB、抗-H反應(yīng)，反定型與Ac，Bc，Oc，自身細(xì)胞(4℃，室溫，37℃)反應(yīng)，試管法血型定型參考文獻(xiàn)[5]操作。

1.3.2 基因組DNA提?。翰捎肕agCore Nucleic Acid Extractor提取儀器進(jìn)行全基因組DNA抽提，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。標(biāo)本A260nm/A280nm比值為1.70～1.90，調(diào)節(jié)標(biāo)本DNA濃度為50～100 ng/μl。

1.3.3 ABO基因擴增和測序分析：參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行操作。簡要如下：采用特異性引物擴增外顯子6～7序列，擴增反應(yīng)總體積20 μl，包括10×PCR緩沖液，DNA，LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司產(chǎn)品，大連)；dNTP和MgCl2終濃度分別為0.2 mmol/L和2.0 mmol/L，引物終濃度為0.5 μmol/L。擴增產(chǎn)物經(jīng)酶切純化后進(jìn)行測序反應(yīng)，測序產(chǎn)物在ABI PRISM 3730測序儀進(jìn)行電泳分析。使用SeqScape V2.5軟件進(jìn)行序列分析比對，根據(jù)堿基多態(tài)性判定標(biāo)本ABO等位基因型。ABO等位基因參照國際輸血協(xié)會(ISBT)工作組的命名原則。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料用百分率(%)表示。

2 結(jié)果

2.1 A2B亞型的分布情況 535例AB表型案例，其中男性278例，女性257例。在535例AB型樣本中，檢出12例A2B亞型標(biāo)本，比例為2.24%。

2.2 A2B個體ABO基因測序情況 基因測序顯示2例標(biāo)本基因型為ABO*A2.01/ABO*B.01，6例為ABO*A2.05/ABO*B.01，1例為ABO*BA.02/ABO*O.01.02，3例為ABO*A1.02/ABO*B.01。人群ABO*A2.05等位基因頻率為0.56%，ABO*A2.01為0.19%。12例標(biāo)本堿基序列多態(tài)性情況見表1。ABO基因雙鏈測序分析見圖1。

表1 12例標(biāo)本堿基序列多態(tài)性情況

圖1 ABO*A2.01/ABO*B.01基因型標(biāo)本(上圖,箭頭所指處為c.1061C/del雜合)和ABO*A2.05/ABO*B.01基因型標(biāo)本(下圖，箭頭所指處為c.1009AG雜合)

3討論血型鑒定是保證臨床輸血安全的首要環(huán)節(jié)，通常利用血清學(xué)技術(shù)可準(zhǔn)確鑒定ABO表型，但人群中存在一定比例ABO亞型，它們往往表現(xiàn)為抗原抗體減弱或者正反定型不一致，不僅干擾輸血前血型鑒定試驗，還影響輸血的安全和效果[7-8]?，F(xiàn)已知ABO血型系統(tǒng)存在的亞型中以A2和A2B較為常見，但目前我國輸血前試驗沒有要求常規(guī)檢測A2抗原，存在A2或A2B亞型漏檢的可能。若將獻(xiàn)血者A2B亞型誤定為AB型輸注給AB型患者，不會導(dǎo)致溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生；但對于受血者而言，將A2B亞型誤定為AB型，輸血后則有可能刺激患者產(chǎn)生抗-A1抗體[3-4]，從而導(dǎo)致遲發(fā)型溶血性輸血反應(yīng)或輸注無效的發(fā)生。因此A2B個體的輸血問題應(yīng)引起臨床重視。

YING等[9]對浙江漢族人群的研究發(fā)現(xiàn)A2B在AB人群中的比例為1.96%，OGASAWARA等[10]研究發(fā)現(xiàn)，日本東京人群中A2B在AB型頻率為0.16%，本實驗的篩查數(shù)據(jù)表明唐山地區(qū)人群中存在一定比例的A2B亞型。國外研究顯示1%～8%的A2個體血清中含有抗-A1抗體，22%～35%的A2B個體血清中含有抗-A1抗體[2]，但是本實驗中我們在12例A2B個體均未發(fā)現(xiàn)抗A1抗體，這與YING等[9]報道的研究結(jié)果一致，他們在134例A2和A2B個體中只發(fā)現(xiàn)1例存在抗A1抗體，提示中國人群中A2或A2B個體血清中含有抗-A1的概率遠(yuǎn)低于白種人群[9]。

A2表型的分子機制主要是ABO基因堿基的點突變或缺失[9]，目前ISBT正式命名的A2等位基因有18個[11]。我們的實驗結(jié)果顯示本地區(qū)以ABO*A2.05為主，與國內(nèi)其他地區(qū)的研究結(jié)果相符[9，12-13]。與ABO*A1.02等位基因進(jìn)行比較，ABO*A2.01在1 061位C缺失從而引起移碼突變，使得A2糖基轉(zhuǎn)移酶與A1糖基轉(zhuǎn)移酶相比活力降低了30～50倍[10]。而ABO*A2.05僅存在1009位A>G，導(dǎo)致337位精氨酸變?yōu)楦拾彼?，推測這個氨基酸的改變可能降低了糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。此外還檢出1例罕見ABO*BA.02等位基因，由于B(A)表型與A2B個體的血清學(xué)特性基本相似，常規(guī)的篩選中可能將B(A)表型誤認(rèn)為A2B表型，但正確鑒定B(A)亞型，對新生兒溶血病的防治和安全輸血有著極其重要的作用。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)3例A2B標(biāo)本基因型為正常的ABO*A1.02/ABO*B.01基因型，YING等[9]通過ABO基因全部外顯子研究結(jié)果也顯示浙江漢族人群部分A2B個體，在測序序列范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)突變。他們推測表觀遺傳、內(nèi)含子紅系特異性調(diào)控元件或其他機制可能影響這些A2B個體抗原的表達(dá)，這有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，河北省唐山地區(qū)人群中存在一定比例的A2B亞型，準(zhǔn)確的血型鑒定有助于提升輸血的安全性和有效性，可預(yù)防不相合輸血導(dǎo)致的溶血性輸血反應(yīng)或輸注無效。