余 娜 ，李瓊瑜 ，陳友琴 ，4，Thomas Joseph SFERRA，4，褚劍鋒 ，2，3，林 珊 ，3，彭 軍 ，2，3

（1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學陳可冀學術(shù)思想傳承工作室，福建 福州 350122；4.凱斯西儲大學醫(yī)學院，美國 克利夫蘭 44106）

動脈血管重構(gòu)是高血壓靶器官損害的病理過程，控制血壓，改善動脈血管重構(gòu)，是防治高血壓并發(fā)癥的基礎(chǔ)［1］。血管重構(gòu)是一個動態(tài)過程，包括血管平滑肌細胞（VSMCs）的增殖、遷移、凋亡和細胞外基質(zhì)合成、降解、重排等一系列過程。VSMCs的異常增殖和遷移引起的血管平滑肌變厚、收縮力增加和血管順應性下降，導致血壓明顯升高［2］。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）在高血壓的發(fā)生發(fā)展和終末器官損害中起重要作用［3］。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）作為RAAS中血壓和心血管穩(wěn)態(tài)的主要生理調(diào)節(jié)因子，能夠介導VSMCs活化、增殖和遷移等多種反應，進一步引起血管平滑肌變厚，血管收縮力及阻力增加，血壓升高［4-6］，因此，抑制 AngⅡ誘導的 VSMCs異常增殖和遷移對防治高血壓具有重要意義。

清達顆粒（QDG）化裁自清眩降壓湯，是陳可冀院士60余年防治高血壓的臨床專方，主治新發(fā)高血壓或高血壓前期陽亢證患者（肝火上炎、肝陽上亢證等），臨床療效穩(wěn)定、可靠。課題組前期研究證實：清眩降壓湯可顯著降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓，參與調(diào)控高血壓引起的血管重構(gòu)［7-8］。為了探討清眩降壓湯化裁方QDG是否參與調(diào)控高血壓引起的血管重構(gòu)，本文研究了QDG對AngⅡ誘導VSMCs增殖和遷移的影響，以期為QDG臨床應用提供進一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6只8周齡雄性SD大鼠，體重（150～200）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2017-0005。

1.2 實驗藥物 清達顆粒組成：天麻12 g，鉤藤10 g（后下），黃芩6 g，蓮子心 5 g，由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：1704306。

1.3 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素、鏈霉素）、0.25%胰蛋白酶（trypsin）購自美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Hyclone 公司；AngⅡ干粉（美國 Sigma 公司）；Hoechst染色液（南京凱基生物科技有限公司）；α-SM-actin抗體（美國Abcam公司）；CCK-8試劑（日本同仁化學公司）；結(jié)晶紫（北京索萊寶科技有限公司）。

1.4 主要儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；Forma系列CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；Countes全自動細胞計數(shù)儀（美國Life Technologies公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica儀器有限公司）；ECLIPSE Ti-DH型熒光倒置顯微鏡（日本尼康公司）。

1.5 實驗方法

1.5.1 大鼠胸主動脈VSMCs原代培養(yǎng)及鑒定 采用組織貼塊法。在無菌操作下取出大鼠胸主動脈，在DMEM高糖培養(yǎng)基中剝離外膜結(jié)締組織，剖開血管，輕輕刮去內(nèi)皮細胞，剝離出來的中膜用眼科剪剪成約1 mm3左右的組織塊，均勻地平鋪于培養(yǎng)瓶中；瓶底朝上，瓶內(nèi)加入含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1 h后將培養(yǎng)瓶翻正，使組織塊完全浸泡在培養(yǎng)液中；靜止培養(yǎng)5 d后換液，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀況。VSMCs采用表型標志蛋白α-SM-actin進行免疫熒光染色鑒定，取3～6代的VSMCs進行實驗。

1.5.2 實驗分組 將VSMCs分為：① 對照組：未加入 AngⅡ及 QDG；② AngⅡ組；③ AngⅡ＋QDG 0.125 mg／mL 組；④ AngⅡ＋QDG 0.25 mg／mL 組；⑤ AngⅡ＋QDG 0.5 mg／mL組。以上②～⑤組AngⅡ的濃度均為10-6mol／L。

1.5.3 CCK-8法檢測細胞活力 在96孔板中接種細胞，每孔加入3×103個細胞，每組做6個復孔；培養(yǎng)24 h后，用無血清的DMEM饑餓24 h，按以上分組給藥干預；在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，配制含10%CCK-8的空白培養(yǎng)基以換液形式加入，4 h后終止培養(yǎng)，充分振蕩混勻后在全自動酶標儀450 nm波長處測定吸光度值（A值）。根據(jù)公式計算：

細胞增殖率／%＝［AngⅡ組 A值／（對照組 A值－1）］×100%

細胞抑制率／%＝［（1－AngⅡ＋QDG組A值）／AngⅡ組A值］×100%

1.5.4 劃痕實驗檢測劃痕損傷修復 在6孔板中接種細胞，每孔加入3×105個細胞，每組做3個復孔；當匯合度達到80%～90%時，用無血清的DMEM饑餓24 h，進行劃痕；隨后吸出原培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍，最后一遍PBS保留不吸出，進行拍照，記為0 h；吸棄PBS，按以上分組給藥干預，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，6、12、24 h隨機取6個視野，在倒置顯微鏡下進行觀察拍照。

1.5.5 Transwell遷移分析 在6孔板中接種細胞，每孔加入3×105個細胞，每組做3個復孔；培養(yǎng)24 h后，用無血清的DMEM饑餓24 h，按以上分組給藥干預24 h后，棄去含藥培養(yǎng)基，消化離心收集細胞，用空白培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細胞密度為1.5×105個／mL；上室內(nèi)加入200μL重懸的細胞，下室加入700μL完全培養(yǎng)基，每組做3個復孔，放入培養(yǎng)箱中培育；24 h后棄去培養(yǎng)基，用蘸有PBS的棉簽輕輕擦拭小室膜上側(cè)的細胞，將小室膜下側(cè)的細胞用4%多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色，PBS洗滌后于倒置顯微鏡下隨機選取6個視野拍照。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0的統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，不符合正態(tài)分布以中位數(shù)表示。計量資料符合正態(tài)分布采用t檢驗，不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠VSMCs原代培養(yǎng) 組織塊貼壁第7天，組織塊邊緣開始有少量細胞爬出，大部分呈長梭形，小部分呈多角形或不規(guī)則形（圖1A）；第10天，可見細胞沿著組織塊周邊大量爬出，呈放射性生長（圖1B）；第12天，細胞生長密度達到90%左右，細胞為梭形、長梭形，呈典型“峰-谷”狀生長現(xiàn)象（圖1C）。結(jié)果表明原代培養(yǎng)成功。

圖1 大鼠VSMCs原代培養(yǎng)圖片（×100）

2.2 大鼠VSMCs免疫熒光染色并用Hoechst和表型標志蛋白 α-SM-actin進行免疫熒光染色顯示：藍色熒光代表細胞核 （圖2A），綠色熒光代表α-SM-actin蛋白陽性細胞（圖2B），圖2C為細胞核和α-SM-actin蛋白陽性細胞合并圖，陽性細胞率達95%以上，表明所培養(yǎng)的原代細胞為VSMCs。

2.3 QDG對AngⅡ誘導VSMCs增殖的影響 見表1。與對照組比較，AngⅡ誘導的VSMCs增殖能力顯著升高（P＜0.01）；不同濃度的QDG可以顯著抑制AngⅡ誘導的 VSMCs增殖（P＜0.01）；且隨 QDG 濃度的增加，對VSMCs增殖的抑制作用也逐漸增強。說明QDG對AngⅡ誘導的VSMCs增殖有抑制作用，且呈劑量依賴性。

2.4 QDG對AngⅡ誘導VSMCs劃痕損傷修復的影響 與對照組比較，AngⅡ能顯著增加VSMCs劃痕損傷的修復，不同濃度的QDG可以顯著抑制AngⅡ誘導VSMCs劃痕損傷的修復，見圖3。

2.5 QDG對AngⅡ誘導VSMCs遷移的影響 見圖4。與對照組比較，AngⅡ能夠顯著增加VSMCs的遷移能力（P＜0.01）；不同濃度的QDG能夠顯著抑制AngⅡ誘導的 VSMCs遷移（P＜0.01），且隨 QDG 濃度的增加，對VSMCs遷移的抑制作用也逐漸增強。說明QDG對AngⅡ誘導的VSMCs遷移有抑制作用，且呈劑量依賴性。

圖2 大鼠VSMCs免疫熒光染色圖（×100）

表1 QDG對AngⅡ誘導VSMCs增殖的影響（±s）

表1 QDG對AngⅡ誘導VSMCs增殖的影響（±s）

注：與對照組比較，1） P＜0.01；與 AngⅡ組比較，2） P＜0.01；與 AngⅡ＋QDG 0.125 mg／mL 組比較，3） P＜0.01；與 AngⅡ＋QDG 0.25 mg／mL 組比較，4） P＜0.01。

組別對照組AngⅡ組AngⅡ＋QDG 0.125 mg／mL 組AngⅡ＋QDG 0.25 mg／mL 組AngⅡ ＋QDG 0.5 mg／mL 組24 h 100.00±4.00 123.98±1.341）115.03±2.702）108.39±1.732）3）97.21±1.222）3）4）細胞活力／%48 h 100.00±3.73 126.68±5.621）113.25±2.262）104.61±2.942）3）99.21±2.322）3）4）

圖3 QDG對AngⅡ誘導VSMCs劃痕損傷修復的影響（×100）

3 討 論

血壓主要是由血管張力維持的，而血管張力主要是由血管平滑肌決定的［9］。VSMCs位于血管中膜，在正常成人體內(nèi)是通過緩慢和輕度收縮來維持血管壁的張力［10］。VSMCs根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同可分為收縮型和合成型兩種表型，在胚胎時期或病理因素刺激下VSMCs由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，合成型的VSMCs可從中膜遷移至內(nèi)膜，并在內(nèi)膜中大量增殖，成為高血壓等血管性疾病的主要原因［11］。

RAAS可通過調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)平衡以及血管張力等方面在高血壓的發(fā)生發(fā)展和終末器官損害中扮演著重要的角色。AngⅡ作為腎素血管緊張素的一種重要的生物活性肽，與VSMCs上的AT1受體結(jié)合后，可通過激活多條胞內(nèi)信號通路促進VSMCs增殖、遷移，導致血管壁硬化、管腔狹窄等［3，12］。 因此，抑制AngⅡ介導的血管平滑肌細胞增殖和遷移是緩解或降低血壓升高的重要途徑之一。

圖4 QDG對AngⅡ誘導VSMCs遷移的影響

本研究中，CCK-8檢測結(jié)果顯示：不同濃度的QDG可顯著抑制AngⅡ誘導的VSMCs增殖，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。VSMCs遷移是血管重構(gòu)的重要驅(qū)動因素，劃痕實驗是測定細胞遷移運動與修復能力的方法，通過體外觀察細胞是否生長（修復）至中央劃痕區(qū)，以此判斷細胞的遷移能力。在本實驗中，QDG對AngⅡ誘導的VSMCs劃痕損傷修復具有明顯的抑制作用，提示QDG可抑制AngⅡ誘導的VSMCs遷移能力。Transwell是通過計算相同時間內(nèi)穿過小孔膜的細胞數(shù)來反映細胞遷移能力，穿過小孔膜的細胞數(shù)越多，遷移能力越強。Transwell實驗結(jié)果表明：與對照組比較，AngⅡ誘導后有較多的VSMCs穿過小孔膜，QDG干預后，穿過小孔的VSMCs數(shù)量逐漸減少，進一步說明QDG能顯著降低AngⅡ誘導的VSMCs遷移能力。

鑒于QDG對AngⅡ誘導的VSMCs增殖和遷移具有顯著作用，其相關(guān)調(diào)控機制、作用靶點和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)值得進一步研究，其結(jié)果有望為QDG的臨床運用提供充足的實驗依據(jù)。