張 蝶，王苗苗，李桂華，劉嘉琪，何國威，劉 建，唐偉卓

(長沙學院 生物與環(huán)境工程學院，長沙 410022)

桂花(OsmanthusfragransL.)為我國的十大傳統(tǒng)名花之一，主要分布在我國南方，并被廣泛種植。受自然環(huán)境和種質(zhì)遺傳的影響，桂花品種種類繁多，如金桂(Osmanthusfragransvar. thunbergii Makino)、銀桂(Osmanthusfragransasiaticus Nakai)、丹桂(Osmanthusfragransvar.Auranticaus) 和四季桂(Osmanthusfragransvar.Semperflorens)[1-3]。桂花果實油脂含量豐富，果實含油量可達11%，具有開發(fā)成為新型油脂原料的潛力。

我國作為桂花的主要產(chǎn)區(qū)，擁有大量的桂花果實資源[4]?，F(xiàn)階段桂花果實的應(yīng)用除了少數(shù)作為種質(zhì)資源進行桂花育苗和觀賞栽培外[5-6]，多數(shù)沒有得到充分利用，造成了巨大的浪費。據(jù)文獻查詢，已有部分研究者對桂花果實油脂中脂肪酸類成分進行了提取分析[7-8], 但是利用不同提取方法提取并比較桂花果實油脂得率的研究鮮見報道。因此，本文采用3種提取方法(快速溶劑提取、超聲輔助提取、回流提取)優(yōu)選桂花果實油脂的提取工藝，確定桂花果實油脂提取的最佳提取方法和工藝參數(shù)；同時對桂花4個品種(金桂、銀桂、丹桂和四季桂)果實油脂得率進行比較，篩選制備桂花果實油脂的最佳品種；進一步對制備的最佳品種果實油脂的脂肪酸組成進行分析，為桂花果實資源的開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

桂花4個品種(金桂、銀桂、丹桂和四季桂)去皮干燥果實(含水量為7.8%)，2017年7月購自江蘇省宿遷市，經(jīng)長沙學院陳建榮副教授鑒定為木犀屬植物桂花的成熟果實。

甲醇、正己烷均為色譜純，德國Merck公司；石油醚(60～90℃)、甲醇均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；5種脂肪酸標準品(純度>98%)，青島科創(chuàng)質(zhì)量檢測有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

HPSEgemini-EVS快速溶劑提取儀；103B型高速中藥粉碎機；TMT-3型電子天平；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵；101A-2B型電熱鼓風干燥箱；Thermo Fisher Trace 1310 ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國 Thermo Fisher Scientific。

1.2 實驗方法

1.2.1 桂花果實油脂的快速溶劑提取

桂花果實(四季桂)粉碎過60目篩，精密稱取4.00 g桂花果實粉末，與適量的硅藻土混合，轉(zhuǎn)移至萃取管內(nèi)，備用。以正己烷為溶劑，待調(diào)節(jié)好提取溫度、提取壓力和提取時間后開始提取，最終收集提取液120 mL，過濾回收，得桂花果實油脂提取物，烘干至恒重后，稱重，計算油脂得率。

1.2.2 桂花果實油脂的回流提取

將桂花果實(四季桂)粉碎并過60目篩，精密稱取4.00 g桂花果實粉末至圓底燒瓶內(nèi)，加入一定量的石油醚，置于電熱恒溫水浴鍋內(nèi)進行提取，提取2次，合并提取液，回收溶劑，得桂花果實油脂提取物，干燥至恒重，稱重，計算油脂得率。

1.2.3 桂花果實油脂的超聲輔助提取

將桂花果實(四季桂)粉碎并過60目篩，精密稱取4.00 g桂花果實粉末至錐形瓶內(nèi)，加入一定量的石油醚，置于超聲儀進行提取，提取2次，合并提取液，回收溶劑，得桂花果實油脂提取物，干燥至恒重，稱重，計算油脂得率。

1.2.4 桂花果實油脂提取工藝條件實驗設(shè)計[9]

1.2.4.1 快速溶劑提取法單因素實驗設(shè)計

為考察提取時間、提取溫度、提取壓力對桂花果實油脂得率的影響，單因素實驗分別設(shè)置為提取時間(2、4、6、8、10 min)、提取溫度(89、92、94、96、99℃)、提取壓力(5、7、9、11、13 MPa)各5個梯度水平進行實驗。在進行某一單因素考察時，保持其他兩個因素水平一致。設(shè)置的固定因素水平分別為提取時間6 min、提取溫度94℃、提取壓力9 MPa。

1.2.4.2 回流提取法單因素實驗設(shè)計

為考察回流時間、回流溫度、料液比對桂花果實油脂得率的影響，單因素實驗分別設(shè)置為回流時間(30、60、90、120、150 min)、回流溫度(65、70、75、80、85℃)、料液比(1∶5、1∶9、1∶13、1∶17、1∶21)各5個梯度水平進行實驗。在進行某一單因素實驗時，保持其他兩個因素水平一致。設(shè)置的固定因素水平分別為回流時間90 min、回流溫度75℃、料液比1∶13。

1.2.4.3 超聲輔助提取法單因素實驗設(shè)計

為考察超聲溫度、超聲時間、料液比對桂花果實油脂得率的影響，單因素實驗分別設(shè)置為超聲時間(10、20、30、40、50 min)、超聲溫度(40、45、50、55、60℃)、料液比(1∶5、1∶9、1∶13、1∶17、1∶21)各5個梯度水平進行實驗。在進行某一單因素實驗時，保持其他兩個因素水平一致。設(shè)置的固定因素水平分別為超聲時間30 min、超聲溫度50℃、料液比1∶13。

1.2.4.4 正交實驗優(yōu)化

經(jīng)上述各種提取方法的單因素實驗結(jié)果分析后，以桂花果實油脂得率作為考察指標，進行L9(33)正交優(yōu)化實驗。

1.2.5 桂花果實油脂的脂肪酸組成分析

1.2.5.1 甲酯化

準確稱取桂花果實油脂樣品1.0 g于圓底燒瓶中，加入5%氫氧化鉀-甲醇溶液 (2 mL)，于40℃恒溫水浴20 min。待反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，加入正己烷(2 mL)溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中定容。靜置24 h，吸取上層有機相，經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾，待GC-MS檢測。

1.2.5.2 GC-MS分析條件

GC條件：TG-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；以高純氦氣(99.999%)為載氣，流速1.2 mL/min;升溫程序為初始溫度80℃，保持1 min，隨后以10℃/min 升溫至200℃，再以5℃/min 升溫至250℃，最后以2℃/min升溫至270℃，保持3 min；進樣口溫度 290℃；進樣量1 μL；不分流進樣，開閥時間1 min。

MS條件:EI電離源；電離源溫度280℃；溶劑延時5 min；電子轟擊能量70 eV；掃描范圍30～400；分辨率1 000。

2 結(jié)果與討論

2.1 桂花果實油脂提取單因素實驗

2.1.1 快速溶劑提取法單因素實驗(見圖1)

圖1 快速溶劑提取法不同因素對桂花果實油脂得率的影響

由圖1可知，提取時間、提取溫度、提取壓力對桂花果實油脂得率均有明顯影響。在快速溶劑提取工藝下，油脂得率隨著提取時間、提取溫度、提取壓力的增加而逐漸增加。在提取時間大于6 min、提取溫度高于94℃、提取壓力大于9 MPa后，油脂得率略有降低?；谀苄Ш统杀究紤]，選擇提取時間6 min、提取溫度94℃、提取壓力9 MPa為基礎(chǔ)進行后續(xù)正交實驗。

2.1.2 回流提取法單因素實驗(見圖2)

圖2 回流提取法不同因素對桂花果實油脂得率的影響

由圖2可知，回流時間、回流溫度、料液比對桂花果實油脂得率均有明顯的影響。在回流提取工藝下，油脂得率隨著回流時間、回流溫度、料液比的增加而逐漸增加。在回流時間大于60 min、回流溫度高于75℃、料液比大于1∶13后，油脂得率略有降低?；谀苄Ш统杀究紤]，選擇回流時間60 min、回流溫度75℃、料液比1∶13為基礎(chǔ)進行后續(xù)正交實驗。

2.1.3 超聲輔助提取法單因素實驗(見圖3)

圖3 超聲輔助提取法不同因素對桂花果實油脂得率的影響

由圖3可知，超聲時間、超聲溫度、料液比對桂花果實油脂得率均有明顯的影響。在超聲輔助提取工藝下，油脂得率隨著超聲時間、超聲溫度、料液比的增加而逐漸增加。在超聲時間大于30 min、超聲溫度高于55℃、料液比大于1∶13后，油脂得率略有降低?；谀苄Ш统杀究紤]，選擇超聲時間30 min、超聲溫度55℃、料液比1∶13為基礎(chǔ)進行后續(xù)正交實驗。

2.2 桂花果實油脂提取正交實驗

2.2.1 桂花果實油脂快速溶劑提取正交實驗

在2.1.1單因素實驗基礎(chǔ)上，對桂花果實油脂的快速溶劑提取進行正交實驗，因素水平見表1，正交實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 快速溶劑提取法因素水平

表2 桂花果實油脂快速溶劑提取正交實驗設(shè)計及結(jié)果

由表2可知，在快速溶劑提取法下，提取時間對油脂得率影響最大，其次為提取壓力和提取溫度。最佳提取因素水平組合為A1B3C3，即提取壓力為7 MPa、提取溫度為96℃、提取時間為8 min。

2.2.2 桂花果實油脂回流提取正交實驗

在2.1.2單因素實驗基礎(chǔ)上，對桂花果實油脂的回流提取進行正交實驗，因素水平見表3，正交實驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

表3 回流提取法因素水平

表4 桂花果實油脂回流提取正交實驗設(shè)計及結(jié)果

由表4可知，在回流提取工藝下， 各因素對桂花果實油脂得率的影響大小依次為C>B>A。參考表4中的油脂得率，確定最佳提取因素水平組合為A1B2C2，即回流時間為30 min、回流溫度為80℃、料液比為1∶13。

2.2.3 桂花果實油脂超聲輔助提取正交實驗

在2.1.3單因素實驗基礎(chǔ)上，對桂花果實油脂的超聲輔助提取進行正交實驗，因素水平見表5，正交實驗設(shè)計及結(jié)果見表6。

表5 超聲輔助提取法因素水平

表6 桂花果實油脂超聲輔助提取正交實驗設(shè)計及結(jié)果

由表6可知，在超聲輔助提取工藝下各因素對桂花果實油脂得率的影響大小依次為C>A>B。最佳提取因素水平組合為A1B2C2，即超聲時間為20 min、超聲溫度為55℃、料液比為1∶13。

2.3 驗證實驗

對桂花果實油脂3種提取方法的最佳工藝條件進行驗證實驗，結(jié)果如表7所示。

表7 桂花果實油脂3種提取方法最佳工藝結(jié)果比較

由表7可知，3種提取方法中，快速溶劑提取法的油脂得率最高，確定為桂花果實油脂提取的最適方法。

2.4 不同品種桂花果實油脂得率比較

采用快速溶劑提取法的最佳提取工藝條件，對桂花4個品種果實的油脂得率進行比較分析。結(jié)果如表8所示。

表8 最佳工藝提取下不同品種桂花果實油脂得率比較

由表8可知，桂花4個品種果實中，四季桂品種果實油脂得率最高，可以確定為桂花果實油脂制備的最適品種。

2.5 四季桂果實油脂脂肪酸組成

采用NIST05標準譜庫對分析的樣品進行峰匹配，逐一對應(yīng)進行定性分析，采用混合標準品和面積歸一化法進行定量分析。四季桂果實油脂脂肪酸組成及相對含量見表9。

表9 四季桂果實油脂脂肪酸組成及相對含量 %

由表9可知，四季桂果實油脂中共檢出18種脂肪酸成分，主要成分為順-10-十五碳烯酸、硬脂酸、油酸、亞油酸。其中，單不飽和脂肪酸相對含量達57.14%，以油酸為主(43.16%)；多不飽和脂肪酸相對含量達38.34%，以亞油酸為主(38.02%)。

3 結(jié) 論

本文以油脂得率作為考核指標，采用單因素實驗和正交實驗優(yōu)選了桂花果實油脂的不同提取方法(快速溶劑提取、超聲輔助提取和回流提取)的工藝，通過比較，確定了快速溶劑提取法為桂花果實油脂提取的最佳方法，其最佳工藝條件為提取時間8 min、提取壓力7 MPa、提取溫度96℃，此條件下桂花果實油脂得率為29.8%。此外，對桂花4個品種果實的油脂得率進行比較分析，確定四季桂品種果實為桂花果實油脂的最適制備原料。經(jīng)GC-MS分析，四季桂果實油脂中含18種脂肪酸，主要為油酸、亞油酸、硬脂酸、順-10-十五碳烯酸，其中不飽和脂肪酸含量較高，單不飽和脂肪酸含量為57.14%，主要以油酸為主；多不飽和脂肪酸含量為38.34%，主要以亞油酸為主。