張紅莉，李勇，許均華，鄭文，徐文泱，歐露真，代洪梅

（1.郴州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，湖南郴州423000；2.郴州市疾病預(yù)防控制中心，湖南郴州423000；3.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南長沙410111）

沙門氏菌是人畜共患病原菌之一，菌體溶解時(shí)，其細(xì)胞壁所含的脂多糖釋放出來，形成內(nèi)毒素[1]，可引起傷寒與副傷寒（腸熱癥）、慢性腸炎、敗血癥、食物中毒等。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近3 000 個(gè)種[2]，確認(rèn)的沙門氏菌血清型有2 579 種[3]，每年全球因食品中沙門氏菌污染而引起的感染病例數(shù)以億計(jì)，在世界范圍內(nèi)引起的食物中毒病例中常常排在首位[4-5]，目前也有文獻(xiàn)報(bào)道亞利桑那沙門氏菌感染人類致病的案例[6-8]。

由于亞利桑那沙門氏菌表型和生化反應(yīng)極不穩(wěn)定，因此明確其最優(yōu)檢測方法在食品安全檢驗(yàn)中顯得尤為重要。目前常用的檢測方法有：利用生化反應(yīng)的常規(guī)檢驗(yàn)方法，如傳統(tǒng)生化國標(biāo)法[9]、VITEK 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)[10]等；利用VIDAS 的酶聯(lián)免疫技術(shù)的法[11-12]等；利用分子生物學(xué)實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）等[13]；利用蛋白質(zhì)譜圖基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法[14-16]等。各方法都存在一定的利弊，本實(shí)驗(yàn)室在2018年的中國合格評定國家認(rèn)可委員會(huì)（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNCA）“巧克力中沙門氏菌檢驗(yàn)”中應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR、VITEK 2、API 20E和GB 4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》4 種不同的檢測方法，分析比較其亞利桑那沙門氏菌檢測效果。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備及試劑

實(shí)時(shí)熒光PCR7500：美國ABI 公司；VITEK 2 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)、API LAB 軟件：法國生物梅里埃公司。

細(xì)菌DNA 提取試劑盒、沙門氏菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）：中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。VITEK 2 21341 革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡（GN 卡）、API 20E 試劑盒：法國生物梅里埃公司。

緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）、四硫磺酸鈉煌綠（tetrathionate broth base，TTB）增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸（seleite cystine broth，SC）增菌液、亞硫酸鉍（bismuth sulfite，BS）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（xylose lysine desoxycholate，XLD）瓊脂、HE（hektoen enteric）瓊脂、三糖鐵（triple sugar iron，TSI）瓊脂、營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）、鄰硝基酚 β-D 半乳糖苷（2-nitrophenyl β-D-galactopyranoside，ONPG）、沙門顯色平板A、沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基B：法國科馬嘉；沙門診斷血清：泰國S&A。

樣品來源：中國合格評定委員會(huì)提供的含亞利桑那沙門氏菌的巧克力樣本。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR 法

1.2.1.1 DNA 提取

把巧克力（NIFDC-PT-135）樣品接種于45 ℃BPW緩沖蛋白胨水中融化后于36 ℃培養(yǎng)18 h，各取1 mL培養(yǎng)物接種10 mL TTB 于42 ℃培養(yǎng)24 h 和10 mL SC于36 ℃培養(yǎng)24 h。取1 mL 培養(yǎng)液于13 000 r/min 離心3 min，吸棄上清，用1 mL 已滅菌的ddH2O 懸浮，13 000 r/min 離心3 min，吸棄上清，重復(fù)上述步驟兩次，加入含有200 μL 細(xì)菌裂解液瞬時(shí)離心后，將含有菌液的離心管沸水浴10 min 后，冷卻2 min，13 000 r/min 離心10 min。取上清液備用。陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控品操作步驟同上，且參與提取，用于對環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。

1.2.1.2 實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系和參數(shù)

實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)體系為20 μL：17 μL Salm PCR反應(yīng)液A（特異性引物、探針、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液等）+3 μL Salm PCR 反應(yīng)液B（熱啟動(dòng)Taq 酶、UDG 酶等）。實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)參數(shù)為：50 ℃，2 min，95 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火延伸45 s，同時(shí)收集FAM 熒光，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束。

實(shí)時(shí)熒光PCR 結(jié)果判定：如果羧基熒光素（5-carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）檢測通道無擴(kuò)增曲線或Ct值＞38，可判樣品為沙門氏菌陰性；如果FAM 檢測通道Ct 值≤38，且曲線有明顯的擴(kuò)增，可判樣品為沙門氏菌陽性。

1.2.2 VITEK 法

樣品按GB4789.4-2016 經(jīng)過選擇性瓊脂平板增菌，經(jīng)TSI、賴氨酸脫羧酶初步生化確定為疑似沙門氏菌后，將菌落純化，配制成菌懸液，充填到GN 卡內(nèi)，封口后放入測試槽內(nèi)，讀取每小時(shí)卡片內(nèi)細(xì)菌在各孔培養(yǎng)基內(nèi)生長變化值，5 h～8 h 后出具結(jié)果。

1.2.3 API 20E 法

樣品按GB4789.4-2016 經(jīng)過選擇性瓊脂平板增菌，經(jīng)TSI、賴氨酸脫羧酶初步生化確定為疑似沙門氏菌后，將菌落純化，配制成菌懸液，接種于試劑條，于36 ℃培養(yǎng)18 h～24 h，觀察生化反應(yīng)結(jié)果。根據(jù)APILAB軟件得到鑒定結(jié)果。

1.2.4 GB 4789.4-2016 法

根據(jù)GB 4789.4-2016 操作步驟進(jìn)行，同時(shí)分別選擇A 和B 兩種顯色培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性分離后，用生化測試盒和血清做后續(xù)的鑒定步驟。

1.2.5 血清學(xué)試驗(yàn)

于潔凈載玻片的測試區(qū)域及對照區(qū)域分別滴一滴抗血清和一滴生理鹽水，用鉑金絲沾取新鮮培養(yǎng)物單菌落一環(huán)，于載玻片上的抗血清和生理鹽水中，分別將培養(yǎng)物和抗血清、培養(yǎng)物和生理鹽水充分混勻，來回傾斜晃動(dòng)載玻片30 s～1 min，觀察凝集現(xiàn)象：O 抗原為顆粒狀凝集；H 抗原為絮狀或絨毛狀凝集。

2 結(jié)果和分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測結(jié)果

取1 mL 增菌液提取DNA 用于實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。增菌液擴(kuò)增出陽性擴(kuò)增曲線。

2.2 VITEK 2法鑒定結(jié)果

全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK 2 鑒定結(jié)果見表1。

全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK 2 分析結(jié)果為：腸沙門菌雙相亞利桑那亞種Salmonella entericassp.diarizonae概率為98%，置信度極好。

2.3 API 20E法鑒定結(jié)果

腸桿菌和其它革蘭氏陰性桿菌鑒定系統(tǒng)API 20E鑒定結(jié)果見表2。

API LAB 軟件分析結(jié)果為：豬霍亂沙門菌亞利桑那亞種Salmonella choleraesuisssp.arizonae的概率為89%，被鑒定菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似程度為0.64。

圖1 亞利桑那沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增圖譜Fig.1 Amplification pattern of Salmonella arizonae by real-time PCR

表1 樣品在GN卡中的生化反應(yīng)結(jié)果Table 1 The biochemical reaction results of the sample in GN card

表2 樣品在API 20E試條中的生化反應(yīng)結(jié)果Table 2 The biochemical reaction results of the sample with API 20E system

2.4 GB4789.4-2016法鑒定結(jié)果

采用國標(biāo)GB 4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》對樣品增菌液培養(yǎng)后再平板劃線分離，由于沙門顯色培養(yǎng)基的成分屬于廠家保密范疇，所以同時(shí)采用了A、B 兩個(gè)廠家的培養(yǎng)基進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果如表3所示。

表3 雙相亞利桑那沙門氏菌在各種選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征Table 3 Colony characteristics of Salmonella arizonae in different culture mediums

雙相亞利桑那在XLD、HE、沙顯A 上的菌落都為非典型形態(tài)，BS、沙顯B 上的菌落形態(tài)特征明顯，尤其是沙顯B 的金屬藍(lán)菌落，可以直接初判為乳糖陽性的沙門氏菌。此疑似陽性菌進(jìn)一步做初步生化，生化反應(yīng)鑒定結(jié)果見表4。

表3和表4結(jié)果符合GB 4789.4-2016 反應(yīng)序號A3 的生化結(jié)果，應(yīng)補(bǔ)做鄰硝基酚β-D 半乳糖苷（2-nitrophenyl β-D-galactopyranoside，ONPG）生化鑒定，標(biāo)準(zhǔn)判讀為ONPG 陰性為沙門氏菌，但實(shí)際檢測結(jié)果ONPG 為陽性，標(biāo)準(zhǔn)并未給出結(jié)論。

進(jìn)一步做沙門氏菌生化群的鑒別，鑒定結(jié)果如表5。

表4 生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果Table 4 The results of biochemical

表5 生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果Table 5 The results of biochemical

以上鑒定結(jié)果符合生化群Ⅲ的特征，需進(jìn)一步血清學(xué)確認(rèn)。

2.5 血清學(xué)確認(rèn)

對3 種方法 （VITEK 2、API 20E 和GB 4789.4-2016）分離出的疑似沙門氏菌進(jìn)行血清學(xué)凝集試驗(yàn)，血清分型結(jié)果為：Ⅲb，菌體O 抗原：60+++；Vi 不凝集；鞭毛H 抗原凝集，H1 相為：r+++，經(jīng)誘導(dǎo)H2 相為：e+++，n+++，x+++，Z15+++[17]。

2.6 分析比較4種方法的優(yōu)劣

從準(zhǔn)確性、檢測步驟、耗時(shí)上比較了4 種檢測方法對巧克力中亞利桑那沙門氏菌的檢測，見表6。

表6 4種檢測方法對巧克力中亞利桑那沙門氏菌的優(yōu)劣比較Table 6 Comparison of the detection results of Salmonella arizona in chocolate by four methods

在準(zhǔn)確性上：1）PCR 法檢出為沙門氏菌陽性，可鑒定到屬；2）VITEK 和API 20E 法結(jié)果都可鑒定到亞種，VITEK 結(jié)果為腸沙門菌雙相亞利桑那亞種Salmonella enterica ssp.diarizonae%id：98，API 20E 結(jié)果為：豬霍亂沙門菌亞利桑那亞種Salmonella choleraesuisssp.arizonae%id 為89.0，根據(jù)血清分型：最終確認(rèn)為：雙相亞利桑那亞種，與VITEK 法檢驗(yàn)結(jié)果一致；3）GB4789.4-2016 法前期的生化鑒定結(jié)果不能完全確定是不是沙門氏菌，必須結(jié)合文獻(xiàn)血清學(xué)鑒定[17]綜合分析，這是由于亞利桑那沙門氏菌表型和生化反應(yīng)極不穩(wěn)定，因此傳統(tǒng)國標(biāo)法受限較大。而由此可見VITEK 法優(yōu)于API 20E、實(shí)時(shí)熒光PCR 法、GB4789.4-2016 法。

由表6可知，操作步驟和時(shí)耗上實(shí)時(shí)熒光PCR 法優(yōu)于VITEK 法優(yōu)于API 20E 優(yōu)于GB4789.4-2016 法。

3 結(jié)論與討論

雙相亞利桑那亞種沙門氏菌寄生于冷血?jiǎng)游锏哪c道內(nèi)，可引起人和其他動(dòng)物感染，國內(nèi)雖有人感染雙相亞利桑那亞種的報(bào)道，但由于血清價(jià)格昂貴，分型繁雜，診斷血清（A-F）群O 血清和Vi 因子均不凝集，給明確診斷帶來了極大的困難。

通過上面4 種檢驗(yàn)方法表明，實(shí)時(shí)熒光PCR 法操作步驟最簡單，耗時(shí)短，效率高，但是該法只鑒定到種，可作為微生物檢驗(yàn)的輔助快篩方式，針對雙相亞利桑那亞種沙門氏菌的鑒定，VITEK 法優(yōu)于API 20E和GB4789.4，該法操作簡便，檢驗(yàn)周期時(shí)短，可直接鑒定到型，且更精準(zhǔn)。但由于雙相亞利桑那亞種沙門氏菌表型和生化反應(yīng)極不穩(wěn)定，在沙顯A 和XLD 上呈現(xiàn)非典型生化特征，極易與大腸埃希菌、枸櫞酸桿菌混淆，所以檢測過程需要結(jié)合分子生物PCR、VITEK、API 20E、GB4789.4-2016 和血清學(xué)五者進(jìn)行綜合診斷判別，否則漏檢的幾率很大。