馮靖，彭效明，*，李翠清，*，王騰，居瑞軍，邱曉，陳亮

（1.北京石油化工學(xué)院，燃料清潔化及高效催化減排技術(shù)北京市重點實驗室，化學(xué)化工國家級示范中心，北京102617；2.北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，北京100176）

銀杏樹是東亞國家的經(jīng)濟樹種，又名白果樹。我國是銀杏樹的故鄉(xiāng)，占有全世界銀杏樹總量的70%以上，銀杏樹的葉、根、果均可作藥用，其中銀杏葉的藥用價值最為突出，這主要是由于銀杏葉中含有豐富的黃酮類化合物，黃酮類化合物是具有色酮環(huán)為基礎(chǔ)的一類化合物，其藥理作用有抗氧化、抗菌、抗腫瘤以及對心腦血管的保護作用等，近年來得到廣泛的應(yīng)用和認(rèn)可。銀杏葉在我國已經(jīng)有60 多年的藥用歷史，可見其藥用價值之可觀，同時也是近10年來學(xué)術(shù)界研究的重點和焦點。因此縮短試驗時間，提高黃酮類化合物的提取量有著非常重要的意義[1-5]。

本文利用超聲-微波輔助聯(lián)合提取法與醇提法來提取銀杏葉中黃酮類化合物，并利用響應(yīng)面的方法優(yōu)化試驗條件，探究最佳試驗條件，此提取方法相比較傳統(tǒng)的提取方法，大大縮短了試驗時間的同時提高了黃酮類化合物的提取量，具有非常重要、深遠的意義，為銀杏葉黃酮類化合物的更廣泛應(yīng)用提供了強而有力的支持[6-10]。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用儀器見表1。

表1 試驗儀器Table 1 Experimental equipment

試驗所用試劑見表2。

表2 試驗試劑Table 2 Experimental reagent

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制：稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，以去離子水定容至50 mL，配制成濃度為0.1 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.10、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4、1.6 mL 到10 mL 棕色容量瓶中，加入70%乙醇，使得溶液體積為2 mL，再加入5%NaNO20.3 mL，搖勻靜置6 min，加入10 %Al（NO3）30.3 mL，搖勻靜置6 min，加入10%NaOH 3.0 mL，搖勻靜置15 min。配制蘆丁含量為：0、0.001 8、0.003 6、0.007 1、0.010 7、0.014 3、0.017 9、0.025、0.022 6 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液[11]。紫外吸光度的測量：開機預(yù)熱紫外分光光度儀0.5 h，分別在510 nm 處測量吸光度，記錄吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 黃酮類化合物檢測方法的方法學(xué)驗證

1.2.2.1 準(zhǔn)確度

取蘆丁含量為：0.035 7 mg/mL 的供試品溶液，加入蘆丁含量為0.071 4 mg/mL 的對照品溶液混合，每個濃度制備3 份供試品溶液進行測定，對9 個測定結(jié)果進行評價[12-16]?；厥章视嬎阋姽剑?）：

式中：C 為實測值；A 為供試品所含被測成分量；B為加入對照品量，利用公式（2）計算得到的回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差：

1.2.2.2 精密度

利用重復(fù)性來表示試驗精密度，取蘆丁含量為0.003 6 mg/mL 的供試品溶液，測定6 次，對測定結(jié)果進行評價。

1.2.2.3 線性

本試驗的線性即為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.4 定量限

將濃度為0.001 8 mg/mL 的溶液測量吸光度后帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算定量限。

1.2.2.5 范圍

將檢測范圍定為線性范圍的±20%，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算檢測范圍。

1.2.2.6 耐用性

利用溶液的穩(wěn)定性來衡量試驗方法的耐用性，取0.023 mg/mL 的待測溶液避光靜置0、1、2、3、4、5、7、10、13、24 h 后分別用分光光度計測定含量。

1.2.3 銀杏葉總黃酮的提取與檢測、計算方法

1.2.3.1 銀杏葉中總黃酮的提取方法

將銀杏葉打磨成粉，過60 目篩，密封后，放入避光處保存。取10 g 已過篩的銀杏葉粉稱量，加入到200 mL 70%的乙醇溶液中，使得液料比為20∶1（mL/g），將溶液放入微波催化合成萃取儀中，設(shè)置微波提取參數(shù)為：微波功率100 W，微波時間2.0 min。完成微波輔助提取后，將溶液攪拌均勻，倒入250 mL 燒杯中，放入超聲波細胞粉碎儀中，進行超聲波提取，設(shè)置超聲波輔助提取參數(shù)：超聲間隙和超聲時間2 s/2 s，超聲功率為228 W，超聲時間4 min。超聲波輔助提取完成后，將溶液放入低速離心機，設(shè)置離心機參數(shù)：離心轉(zhuǎn)速1 500 r/min，離心時間5 min，待離心完成后，取上清液備用，取沉淀物進行二次提取，將二次提取離心后上清液與第一次提取上清液混合，即為提取液，記錄提取液體積[17-20]。

1.2.3.2 總黃酮含量檢測及計算方法

取提取液1 mL 于10 mL 容量瓶中，以70%乙醇定容到10 mL，取1 mL 稀釋液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線黃酮類化合物的檢測方法進行檢測，將測得的紫外吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算銀杏葉中總黃酮類化合物的含量，計算公式如公式3。

式中：A表示紫外分光光度儀檢測數(shù)據(jù)；B表示稀釋倍數(shù)；V表示提取液總體積，mL；m表示銀杏葉粉的質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗

1.2.4.1 超聲時間對黃酮類化合物提取量的影響

按照試驗參數(shù)：微波功率100 W，微波時間2.0 min，液料比20∶1（mL/g），超聲功率228 W，探究超聲時間分別為0、2、4、6、8 min 時對黃酮類化合物提取量的影響。

1.2.4.2 超聲功率對黃酮類化合物提取量的影響

按照試驗參數(shù)：液料比20∶1（mL/g），微波功率100 W，微波時間2.0 min，超聲時間4 min，改變超聲功率，探究超聲功率分別為204、216、228、240、252 W 時對黃酮類化合物提取量的影響。

1.2.4.3 微波時間對黃酮類化合物提取量的影響

按照試驗參數(shù)：液料比20∶1（mL/g），微波功率100 W，超聲時間4 min，超聲功率228 W，探究微波時間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 min 對黃酮類化合物提取量的影響。

1.2.4.4 液料比對黃酮類化合物提取量的影響

按照試驗參數(shù)：微波功率100 W，微波時間2.0 min，超聲時間4 min，超聲功率228 W，改變液料比，探究液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）時液料比對黃酮類化合物提取量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗

以超聲功率（A），超聲時間（B），液料比（C），微波時間（D）為影響因素，黃酮類化合物為響應(yīng)值，利用design expert 8.0 對所得數(shù)據(jù)進行分析擬合，對影響因素進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗因素水平編碼見表3。

表3 試驗因素水平編碼Table 3 Experimental factors level and the coding

1.2.6 提取物鑒定

對提取液進行旋蒸濃縮，冷凍干燥后得到提取物粉末。對粉末進行紅外掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve

即：y=12.256 7x+0.003 96，R2=0.999 04，符合2015年版中華人民共和國藥典一部要求。

2.2 黃酮類化合物檢測方法的方法學(xué)驗證

2.2.1 準(zhǔn)確度

試驗所得回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.19%，符合2015年版中華人民共和國藥典一部要求。

2.2.2 精密度

取濃度為0.003 6 mg/mL 的溶液紫外吸光度，吸光度測定6 次均為：0.044，試驗顯示，重復(fù)性良好，符合2015年版中華人民共和國藥典一部要求。

2.2.3 線性

試驗線性即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗顯示，y=12.256 7x+0.003 96，R2=0.999 04，線性良好，詳見2.1。

2.2.4 定量限

所以將檢測限定為0.001 8 mg/mL，R2達到0.999 04，符合2015年版中華人民共和國藥典一部要求。

2.2.5 范圍

蘆丁檢測范圍試驗結(jié)果見圖2。

圖2 蘆丁檢測范圍Fig.2 Rutin detection range

由圖2可知，將檢測范圍定為：0～0.03 mg/mL，R2達到0.999 41，符合2015年版中華人民共和國藥典一部要求。

2.2.6 耐用性

黃酮類化合物溶液穩(wěn)定性結(jié)果見圖3。

圖3 黃酮類化合物溶液穩(wěn)定性Fig.3 Stability of flavonoid solution

由圖3可知，黃酮類化合物隨著時間的延長，含量會逐漸下降，所以黃酮類化合物的含量應(yīng)盡快檢測，黃酮類化合物溶液也需要現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3 單因素試驗

2.3.1 超聲時間對黃酮類化合物提取量的影響

超聲時間對黃酮類化合物提取量的影響結(jié)果見圖4。

圖4 超聲時間對黃酮類化合物提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction of flavonoids

由圖4可知，超聲時間在4 min 時，黃酮類化合物的提取量最高，達到24.309 5 mg/g，超聲時間過短，會造成黃酮類化合物提取不完全，超聲時間過長，提取量下降迅速，超聲時間過長過強，會使得過強空化作用破壞了黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，從而使得黃酮類化合物的提取量降低。

2.3.2 超聲功率對黃酮類化合物提取量的影響

超聲功率對黃酮類化合物提取量的影響結(jié)果如圖5。

圖5 超聲功率對黃酮類化合物提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the extraction of flavonoids

由圖5可知，超聲功率在228 W 時提取量最高，達到24.309 5 mg/g，超聲功率過小，使得黃酮類化合物提取不完全，同樣的，超聲功率過強，提取量下降迅速，過強的空化作用會破壞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，從而使得黃酮類化合物的提取量降低。

2.3.3 微波時間對黃酮類化合物提取量的影響

微波時間對黃酮類化合物提取量的影響結(jié)果見圖6。

圖6 微波時間對黃酮類化合物提取量的影響Fig.6 Effect of microwave time on the extraction of flavonoids

由圖6可知，微波時間為2.0 min 時，黃酮類化合物的提取量最高，達到24.309 5 mg/g，微波時間多短，使得黃酮類化合物不能完全從銀杏葉中提取出來，微波時間過長，提取溫度上升過高過快，會破壞了黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，從而降低了黃酮類化合物的提取量。

2.3.4 液料比對黃酮類化合物提取量的影響

液料比對黃酮類化合物提取量的影響結(jié)果見圖7。

圖7 液料比對黃酮類化合物提取量的影響Fig.7 Effect of liquid-material ratio on the extraction of flavonoids

由圖7可知，液料比為20∶1（mL/g）時，黃酮類化合物提取量最高，達到24.309 5 mg/g，當(dāng)液料比過小時，黃酮類化合物提取不完全，液料比過大時，過高的乙醇濃度會破壞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，從而降低了黃酮類化合物的提取量。

2.4 響應(yīng)面試驗

利用design expert 8.0 對所得數(shù)據(jù)進行分析擬合，得到黃酮類化合物對A，B，C，D的二次多項回歸方程為：Y=24.31-0.088×A+0.13×B+0.10×C+0.17×D-0.76A×B+0.013×A×D+0.064×B×C+0.35×B×D-0.28×C×D-0.90A2-1.35×B2-1.86×C2-0.33×D2

對黃酮類化合物進行四因素三水平的響應(yīng)面試驗，共29 組響應(yīng)面試驗及結(jié)果見表4。

響應(yīng)面所得到的回歸方程顯著性參數(shù)見表5。

表4 黃酮類化合物響應(yīng)面設(shè)計數(shù)據(jù)Table 4 Response surface design data of flaronoids

表5 回歸方程顯著性及方差分析Table 5 Regression coefficients and ANOVA results

續(xù)表5 回歸方程顯著性及方差分析Continue table 5 Regression coefficients and ANOVA results

由表5可以看出此模型的P值為0.008 2，遠遠小于0.01，回歸方程相關(guān)系數(shù)為0.936 5，證明此模型的顯著性為顯著，擬合模型較好，該試驗的設(shè)計合理，所得到的回歸方程可以較好地反映各個因素對于黃酮類化合物提取量的影響，利用該模型得到的最佳工藝條件是合理的。各個因素對黃酮類化合物的影響排序為：微波時間＞超聲時間＞液料比＞超聲功率，交互項對黃酮類化合物影響排序為超聲功率與超聲時間＞超聲時間與微波時間＞液料比與微波時間＞超聲功率與微波時間大于超聲時間與液料比，二次項對黃酮類化合物影響排序為：液料比＞超聲時間＞超聲功率＞微波時間。

試驗中各個因素交互作用響應(yīng)立體面及對應(yīng)等高線圖8。

由響應(yīng)面所得到的等高線圖和3D 圖見圖8，等高線所得的趨勢線越似橢圓，兩個因素的交互作用就越明顯，所以由圖8可知，超聲功率與超聲時間的交互作用最明顯，而超聲時間與液料比之間的交互作用最弱。同時，由各個因素所得到的3D 圖可知，響應(yīng)面最高點對應(yīng)的各個因素值即為最佳試驗條件，最高點所對應(yīng)的縱坐標(biāo)即為黃酮類化合物的最高提取量[21-23]。

圖8 黃酮類化合物響應(yīng)立體圖與等高線圖Fig.8 Contour map and 3D plot of flavonoid response surface

根據(jù)響應(yīng)面分析得到的黃酮類化合物最佳試驗條件為：超聲功率：227.4 W，超聲時間：2.16 min，液料比：19.75∶1（mL/g），微波時間：1.985 min。為方便試驗操作，最佳條件設(shè)定為：超聲功率：228 W，超聲時間：2 min，液料比20∶1（mL/g），微波時間2 min。為檢驗上述所得最佳試驗條件的可靠性，利用上述最佳工藝條件提取黃酮類化合物，得到黃酮類化合物的提取量為24.309 5 mg/g，理論上可得到黃酮類化合物的提取量為24.322 5 mg/g，相對誤差為0.05%。

2.5 提取物的鑒定

提取物紅外掃描圖譜見圖9。

圖9 提取物的紅外光譜圖Fig.9 Infrared spectrum of the extract

根據(jù)圖9，芳香環(huán)的C-H 伸縮振動峰為3 364、1 657 cm-1為羰基吸收峰，羰基峰本身是出現(xiàn)在1 740 cm-1～1 700 cm-1的峰，此譜圖羰基峰出現(xiàn)紅移是由于羰基與芳香基出現(xiàn)共軛而引起的。1 607 cm-1為苯環(huán)骨架的伸縮振動峰，1 273 cm-1為芳香醚的特征吸收峰。

黃酮類化合物的基本結(jié)構(gòu)見圖10。

由圖10 可知，提取物紅外掃描結(jié)果與與圖10中黃酮類化合物基本結(jié)構(gòu)一致，所以提取產(chǎn)物確定為黃酮類化合物。

圖10 黃酮類化合物基本結(jié)構(gòu)Fig.10 Basic structure of flavonoids

3 結(jié)論與展望

該文采用的微波-超聲聯(lián)合提取黃酮類化合物的方法不僅可以明顯縮短試驗時間，并且在很大程度上提高了銀杏葉中黃酮類化合物的提取量，同時，本文采用Design-Expert 軟件來設(shè)計各個影響因素的響應(yīng)面試驗，建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化了試驗條件，當(dāng)在響應(yīng)面優(yōu)化的最佳試驗條件：超聲時間4 min，超聲功率228 W，微波時間2 min，液料比20∶1（mL/g），銀杏葉中總黃酮的最高提取量達到24.309 5 mg/g。表明此項研究有著重要的意義，為銀杏葉中黃酮類化合物的應(yīng)用提供了更廣闊的前景。