魏琪 楊瀅 田甜

摘 要：采用靜電紡絲制備含有堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）和絲素蛋白（Silk fibroin，SF）的復合膜片（SF/bFGF）。利用掃描電鏡研究SF/bFGF復合膜片的內(nèi)部形態(tài)和結(jié)構(gòu)，利用小鼠皮膚缺損修復實驗分析SF/bFGF對小鼠皮膚缺損修復是否具有促進作用。結(jié)果表明，SF/bFGF復合膜片對小鼠皮膚缺損有促進修復作用。

關(guān)鍵詞：靜電紡絲；絲素蛋白；堿性成纖維細胞生長因子

絲素蛋白（SF）來源于蠶繭，是一種天然結(jié)構(gòu)蛋白，生物相容性好且無毒副作用，有利于細胞貼附和伸展，具有良好的生物降解性，已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學領(lǐng)域，如作為醫(yī)學材料、藥物載體、細胞培養(yǎng)基質(zhì)及手術(shù)縫合線等，在服裝領(lǐng)域、食品領(lǐng)域也有應(yīng)用。尤其在生物醫(yī)學材料領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛和深入，SF可被制作成多種形態(tài)，比如水凝膠、與其他材料復合形成微球或3D材料或者通過靜電紡絲（形成多孔納米材料等。多孔的絲素蛋白材料可被設(shè)計并融合各種生長因子用于組織修復。比如，2014年Tony M.Dinis等人通過絲素蛋白靜電紡絲形成含有神經(jīng)生長因子（Nerve growth factor，NGF）、睫狀神經(jīng)生長因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）的納米纖維，再通過卷曲形成3D支架用于神經(jīng)修復。當大鼠的原代神經(jīng)細胞種于納米纖維上，可使突起的長度增加3倍。2014年Chen等整合雙相磷酸鈣（BCP）與重組人骨形成蛋白2（rhBMP-2）/SF 微球形成BCP/rhBMP-2/SF植入山羊椎體的不同部位看骨的再生情況，在第三個月BCP/rhBMP-2/SF組就可以觀察到非層板骨，椎體不同空間充滿了大量的新生骨小梁；而BCP/rhBMP-2組到第六個月才出現(xiàn)大量的骨小梁及成熟的板層骨。在眾多生長因子中，bFGF在損傷修復中的研究相對比較深入，已被用于多種創(chuàng)傷治療，bFGF在皮膚缺損修復中應(yīng)用的比較多，比如程飚等將bFGF敷于大鼠深Ⅱ度燙傷的皮膚，發(fā)現(xiàn)能促進損傷組織的修復；Sakamoto等將明膠溶液與bFGF溶液混合后與1%的戊二醛交聯(lián)用于小鼠皮膚缺損修復，結(jié)果顯示交聯(lián)混合液促進皮膚缺損愈合。但是目前還沒有SF靜電紡絲作為bFGF的承載材料。因此，本實驗擬通過靜電紡絲制備SF/bFGF復合膜片，以期促進皮膚缺損的修復。

一、實驗部分

（一）材料、試劑與設(shè)備

（1）蠶繭

陜西省安康市安康學院重點蠶桑實驗室提供。

（2）實驗動物

4周齡昆明小鼠，購自第四軍醫(yī)大學動物中心。

（3）試劑

戊巴比妥鈉（Sigma），BCATM蛋白檢測試劑盒（Thermo），胰酶（Hyclone），DMEM（Gibco），非必需氨基酸（Hyclone），PBS（Hyclone），胎牛血清（FBS，Gibco），Na2S（天津天力），其他試劑均為分析純試劑。

（4）儀器

倒置顯微鏡（Nikon），冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司），真空干燥箱（Vacucell 22L，MMM，德國），掃描電子顯微鏡（SEM，Philips）超凈臺（海爾），孵箱（Binder）等。

（二）方法

（1）SF/bFGF復合膜片的制備

將絲素蛋白凍干品配成濃度為28%的溶液，加入bFGF，使bFGF的濃度為10μg/cm2，設(shè)置距接收屏的距離為7cm及電壓為20kv/cm，進行靜電紡絲獲得SF/bFGF復合膜片。

（2）昆明小鼠皮膚缺損修復實驗

實驗前用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，經(jīng)脫毛消毒后在背部制造直徑約1.2cm的圓形缺損，將SF/bFGF復合膜片和SF膜片各貼于昆明小鼠皮膚缺損部位，無貼附組即con組，每組6只昆明小鼠，單籠飼養(yǎng)，每天給小鼠傷口采照，統(tǒng)計傷口的愈合情況。

（3）修復面積的統(tǒng)計學分析

采用IBM SPSS Statistics 20軟件進行小鼠傷口修復面積進行統(tǒng)計分析，使用單因素方差分析各處理之間的顯著性，當P<0.01，具有極顯著性差異；當0.010.05，視為無顯著性差異。

二、結(jié)果與分析

（一）小鼠皮膚缺損修復實驗結(jié)果

（1）昆明小鼠皮膚缺損修復面積的統(tǒng)計分析

缺損修復面積的統(tǒng)計分析顯示，在缺損修復到第12d和18d時，SF/bFGF組比SF組和con組明顯修復加快且修復率與con組具有極顯著性差異（P<0.01）。這些統(tǒng)計數(shù)據(jù)與小鼠皮膚缺損修復大體觀察結(jié)果一致。

三、結(jié)語

絲素蛋白來源于蠶繭，其經(jīng)過脫膠、鹽溶解和透析獲得純凈的絲素蛋白，通過與bFGF混紡獲得SF/bFGF復合膜片，掃描電鏡結(jié)果顯示纖維間有黏連推測復合膜片結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，力學性能較好，SF/bFGF復合膜片是一種相對較好的載體材料。小鼠皮膚缺損修復差異統(tǒng)計結(jié)果顯示，SF/bFGF和SF均能促進小鼠皮膚缺損修復，SF/bFGF尤為明顯，雖然在con組修復的第六天表面看起來比實驗組修復的快，可能的原因是在于制造缺損時con組小鼠皮膚處于緊繃的狀態(tài)。整體結(jié)果說明通過靜電紡絲獲得的SF/bFGF復合膜片表現(xiàn)出了bFGF的天然活性，也說明以絲素蛋白作為bFGF的承載材料是可行的。

參考文獻

[1] Gao Y.Y.，Wang Q.J.，Cui X.B.，et al.Controlled release of stromal cell-derived factor-1 from silk firoin-coated coils accelerates intra-aneurysmal organization and occlusion of neck remnant byrecruiting endothelial progenitor cells.Int J Clin Exp Pathol，2014，7（12）：8366-8380.

[2] Tony M.D.，Guillaume V.，Rodrigo R.J.，et al.Comp-lementary Effects of Two Growth Factors in Multifunctionalized Silk Nanofibers for Nerve Reconstruction，PLOS ONE，2014， 9（10）.

[3] Sakamoto M.，Morimoto N.，Ogino S.，et al.Efficacy of Gelatin Gel Sheets in Sustaining the Release of Basic Fibroblast Growth Factor for Murine Skin cted cell migration，Biomaterials，2005，26（16）：3227-3234.

基金項目：2017年國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃（編號：201711400005）；2018年省級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃（編號：201843005）。