鐘永紅，蘇流坤，劉 敏，宋玉梅，黃子榮，梁家佑，溫才潔

(1.中國(guó)廣州分析測(cè)試中心，廣東 廣州 510070；2.廣東省分析測(cè)試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070)

白藜蘆醇(Resveratrol)是一種植物抗毒素多酚化合物，是植物為了抵御外界病菌入侵而產(chǎn)生的抗毒型物質(zhì)[1]。研究表明，白藜蘆醇具有抗氧化、保肝、抗炎、免疫刺激、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等多種生物活性及免疫調(diào)節(jié)作用[2-3]，能抑制血小板聚集，減少心臟病的發(fā)生和控制其發(fā)展；還有抗菌、抗衰老等作用[4-5]。白藜蘆醇存在于多種植物中，例如：葡萄、花生、桑植等[6]，其中，葡萄中白藜蘆醇的含量最高[7]，常作為白藜蘆醇提取的主要原料。由于葡萄制品天然富含白藜蘆醇，因此可作為人們補(bǔ)充白藜蘆醇的首選佳品。市售的葡萄制品種類(lèi)很多，主要有葡萄酒、飲品、粉劑和膠囊等。由于葡萄制品中白藜蘆醇的含量參差不齊，所以建立葡萄制品中白藜蘆醇的測(cè)定方法很有必要。

目前，白藜蘆醇的檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法、熒光光度法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法和高效液相色譜法等[4,8]。高效液相色譜法具有分離效率快、靈敏度高、適用于熱不穩(wěn)定化合物等優(yōu)點(diǎn)。本文參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法[9]，建立了HPLC法測(cè)定葡萄及其制品中白藜蘆醇含量的方法，可為相關(guān)監(jiān)管部門(mén)提供方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀-二極管陣列檢測(cè)器(LC-20A 2300，日本島津公司)，超聲波清洗器(KQ-220型，昆山市超聲儀器有限公司)，電子天平(BT125D，Sartorius)，漩渦混合器(XW-80A型，上海琪特分析儀器有限公司)，KL512型氮吹儀(北京康林科技有限責(zé)任公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(YRE-201D，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑

白藜蘆醇(99.5%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；甲醇、乙腈(色譜純，Merck)；乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；蒸餾水(自制)。

1.3 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.01256 g白藜蘆醇于25 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，濃度為500 mg/L，此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：從標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，用甲醇定容，配置成濃度為0.5、1.0、5.0、25、50 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

葡萄酒：稱取20.0 g試樣，加2.0 g氯化鈉溶解后，再加25.0 mL乙酸乙酯振蕩萃取，分出乙酸乙酯過(guò)無(wú)水硫酸鈉，重復(fù)一次，合并萃取液后，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃旋轉(zhuǎn)蒸至近干，用甲醇定容至5.0 mL[10]。

葡萄飲品：搖勻后取樣，準(zhǔn)確稱取1.0～10.0 g樣品于50 mL聚丙烯刻度離心管中，用甲醇定容至50 mL，超聲提取10 min后，過(guò)濾上機(jī)。

葡萄皮粉試樣：稱取0.05～0.1 g樣品于100 mL容量瓶中，加入甲醇80 mL，用旋渦混合儀混勻2 min后，超聲提取20 min，過(guò)濾上機(jī)。

膠囊試樣：取20粒膠囊內(nèi)容物，混勻；稱取0.2～0.4 g樣品于100 mL容量瓶中，加入甲醇80 mL，用旋渦混合儀混勻2 min后，超聲提取20 min，冷卻后定容，過(guò)濾上機(jī)[9,11]。

1.5 色譜條件

色譜柱：Agilent C18(4.6 mm×25 0 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm；流動(dòng)相：乙腈/水=30/70。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本實(shí)驗(yàn)選用的高效液相色譜儀配備的檢測(cè)器是光電二極管陣列檢測(cè)器，采用光電二極管陣列檢測(cè)器在190～800 nm波長(zhǎng)范圍對(duì)白藜蘆醇進(jìn)行光譜掃描，得出白藜蘆醇的最大吸收波長(zhǎng)為306 nm，因此檢測(cè)波長(zhǎng)選為306 nm。

2.2 線性范圍和檢出限

用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，配置成濃度分別為0.5、1.0、5.0、25.0、50.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。以白藜蘆醇的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)(X)，求得線性方程為Y = 7049X-11382，線性相關(guān)系數(shù)(R)為0.9999。結(jié)果表明在0.5～50.0 mg/L范圍內(nèi)，白藜蘆醇線性良好，檢出限為0.5 mg/kg(信噪比，S/N = 3)。

2.3 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

分別稱取葡萄復(fù)合飲品、葡萄粉和白藜蘆醇膠囊各8份，其中6份按照“1.4”進(jìn)行樣品前處理，計(jì)算方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，具體結(jié)果見(jiàn)表1；剩余2份做加標(biāo)回收，根據(jù)樣品中白藜蘆醇的含量不同，加入適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液。前處理方法參照“1.4”，求得加標(biāo)回收率結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 白藜蘆醇的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4 日內(nèi)與日間精密度

選定濃度為25.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，得出白藜蘆醇峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%，表明具有良好的日內(nèi)精密度。連續(xù)5天將上述濾液進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，得出白藜蘆醇峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%，表明具有良好的日間精密度。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

樣品前處理按照“1.4”制備后，按照“1.5”進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，得到的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖見(jiàn)圖1，實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

通過(guò)對(duì)20類(lèi)樣品，206個(gè)樣品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明：同一類(lèi)別葡萄制品中白藜蘆醇的含量參差不齊，例如：對(duì)于測(cè)定的8個(gè)不同品牌的葡萄復(fù)合飲品，5個(gè)檢測(cè)結(jié)果為未檢出，其它3個(gè)樣品含量分別為0.152、0.178和0.305 mg/100g。所以，消費(fèi)者想要選擇含有白藜蘆醇的相關(guān)產(chǎn)品時(shí)，不僅要看標(biāo)簽標(biāo)示值，還需要做進(jìn)一步確認(rèn)。20種樣品的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 20種樣品的測(cè)定結(jié)果

圖1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品和3種葡萄制品色譜圖

Fig.1 The chromatogram of resveratrol standard and three grape products

3 結(jié)論

本研究建立了不同類(lèi)別葡萄制品中白藜蘆醇的高效液相色譜分析方法，并對(duì)206個(gè)樣品進(jìn)行含量測(cè)定，白藜蘆醇在0.50～50 mg/L范圍內(nèi)呈良好線性，檢出限為0.5 mg/kg。結(jié)果表明該方法適用范圍廣、重現(xiàn)性好和準(zhǔn)確度高，可為相關(guān)監(jiān)管部門(mén)提供方法參考。