朱彥東,劉 鈺

(1.南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院麻醉科，廣東深圳 518101；2.浙江省東陽(yáng)市紅十字會(huì)醫(yī)院 322100)

隨著麻醉藥物在臨床的廣泛使用，人們開(kāi)始關(guān)注全身麻醉藥對(duì)腦發(fā)育的影響。近年來(lái)有研究顯示，異氟烷等全身麻醉藥會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，具有一定的神經(jīng)毒性[1-2]。目前，發(fā)育期動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)成為研究熱點(diǎn)，但是對(duì)于麻醉藥導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞退化和凋亡的具體機(jī)制仍未十分明確。N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA受體)是離子型谷氨酸受體的1個(gè)亞型，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。研究顯示，N-甲基-D-天冬氨酸-2B受體(NR2B)不僅介導(dǎo)突觸的強(qiáng)化及神經(jīng)元的存活，還可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用,其中Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用[4]。本研究探討七氟醚對(duì)大鼠海馬組織NR2B、Caspase-3的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取SD大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)60只，7 d齡，雌雄各半，飼養(yǎng)環(huán)境為12 h明暗循環(huán)，溫度20～22 ℃，濕度55%～60%，大鼠斷奶前配乳母鼠喂養(yǎng)，自由取食。將大鼠分為對(duì)照組和麻醉組，每組再分為3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即麻醉前、麻醉后24 h及麻醉后7周，每組10只。

1.2方法

1.2.1麻醉方法 大鼠放入麻醉箱，對(duì)照組開(kāi)啟30%空氧混合氣；麻醉組開(kāi)啟七氟醚(濃度2.5%)和30%空氧混合氣，麻醉時(shí)間4 h。

1.2.2Western blot 分別于麻醉前、麻醉后24 h及麻醉后7周取大鼠海馬組織，收集蛋白樣品使用細(xì)胞裂解液，BCA 蛋白定量法檢測(cè)各組蛋白濃度。NR2B用10%分離膠，冷卻到室溫，把蛋白樣品直接上樣到十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳加樣孔內(nèi)，每孔上樣量30 μg，打開(kāi)電泳儀，上層膠時(shí)使用80 V電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用120 V電壓恒壓電泳。恒流 0.22 mA 濕轉(zhuǎn)120 min，轉(zhuǎn)膜完畢后漂洗，5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h。參考一抗說(shuō)明書(shū)，按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗，4 ℃過(guò)夜。洗滌，按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。漂洗后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，根據(jù)一抗的不同，選擇合適的曝光時(shí)間顯影并保存圖像。

1.2.3Morris水迷宮測(cè)試 Morris水迷宮檢測(cè)麻醉后7周大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。大鼠Water Maze水迷宮為上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn)，由圓形水池、圖像自動(dòng)采集和處理系統(tǒng)組成。Morris水迷宮測(cè)試包括定位航行實(shí)驗(yàn)(place navigation)和空間搜索實(shí)驗(yàn)(spatial probe test)，實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練階段連續(xù)進(jìn)行3 d，每天訓(xùn)練4次。觀察和記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)的路線圖及所需時(shí)間，記錄為潛伏期。

2 結(jié) 果

2.1兩組海馬組織NR2B蛋白表達(dá)情況 麻醉前及麻醉后7周，麻醉組和對(duì)照組大鼠海馬組織NR2B蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；麻醉后24 h，麻醉組大鼠海馬組織NR2B蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組及麻醉前(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 兩組海馬組織NR2B蛋白表達(dá)變化

圖2 兩組大鼠海馬組織Caspase-3蛋白表達(dá)

表1 各組Morris水迷宮測(cè)試情況

2.2兩組海馬組織Caspase-3蛋白表達(dá)情況 麻醉前及麻醉后7周，麻醉組和對(duì)照組大鼠海馬組織Caspase-3蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；麻醉后24 h，麻醉組大鼠海馬組織Caspase-3蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組及麻醉前(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3兩組大鼠Morris水迷宮測(cè)試情況 將麻醉后7周大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，麻醉組大鼠第1、3天游泳潛伏期、總路程明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。麻醉組和對(duì)照組游泳速度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

3 討 論

目前針對(duì)全身麻醉藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響的報(bào)道較多。研究顯示，麻醉藥會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，對(duì)發(fā)育期動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有不可逆轉(zhuǎn)的損害[5]。閔娜等[6]將發(fā)育高峰期的大鼠暴露在異氟醚中超過(guò)5 h，發(fā)現(xiàn)大鼠的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生廣泛的退化和死亡。七氟醚為臨床上常用的吸入麻醉藥，廣泛應(yīng)用于兒童手術(shù)，隨著越來(lái)越多地應(yīng)用在臨床，其對(duì)神經(jīng)、心臟系統(tǒng)的不良反應(yīng)也受到研究者的關(guān)注。之前已有許多關(guān)于七氟醚對(duì)神經(jīng)結(jié)構(gòu)和神經(jīng)認(rèn)知功能的影響的報(bào)道。謝思寧等[7]研究報(bào)道，七氟醚對(duì)幼鼠發(fā)育期中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有損害作用。CIECHANOWICZ等[8]將懷孕大鼠長(zhǎng)期暴露超劑量的異氟醚中，發(fā)現(xiàn)幼鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)發(fā)生延遲，但其具體作用機(jī)制目前尚未明確。

NMDA受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，尤其在大腦皮層和海馬廣泛分布。海馬體(Hippocampus)是位于腦顳葉內(nèi)的一個(gè)部位，主要負(fù)責(zé)長(zhǎng)時(shí)記憶的存儲(chǔ)轉(zhuǎn)換和定向等功能[9]。NMDA 受體具有不同的亞型，與學(xué)習(xí)、記憶等多種神經(jīng)功能密切相關(guān)。研究顯示，NMDA 受體參與誘導(dǎo)細(xì)胞的存活和凋亡，在神經(jīng)元細(xì)胞的壞死、凋亡和抗凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。NR2B亞基主要表達(dá)于發(fā)育早期階段，對(duì)NMDA受體的功能起著重要作用。因此本研究選擇NR2B 為大鼠發(fā)育期的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。Caspase家族與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡過(guò)程的中心環(huán)節(jié)[11-12]。Caspase-3在死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中起關(guān)鍵作用[13]。本研究結(jié)果顯示，麻醉后24 h，麻醉組大鼠海馬組織NR2B蛋白和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組及麻醉前(P<0.05)；麻醉前及麻醉后7周，麻醉組和對(duì)照組大鼠海馬組織NR2B蛋白和Caspase-3蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。七氟醚麻醉對(duì)幼鼠海馬組織NR2B、Caspase-3蛋白表達(dá)影響較大，說(shuō)明七氟醚麻醉對(duì)小鼠認(rèn)知功能影響的機(jī)制與海馬組織NR2B、Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)，但具體的影響機(jī)制目前尚不明確，其長(zhǎng)期效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。

Morris水迷宮測(cè)試可很好地反映大鼠海馬的功能，是研究空間學(xué)習(xí)記憶的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域研究[14]。Morris水迷宮測(cè)試通過(guò)在水中設(shè)置隱藏平臺(tái)，記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尋找平臺(tái)所用時(shí)間和所走路徑，判斷動(dòng)物的記憶功能，研究與空間學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的腦區(qū)功能評(píng)價(jià)。本研究中，麻醉組大鼠第1、3天游泳潛伏期、總路程明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，游泳速度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此筆者認(rèn)為，大鼠接受2.5%七氟醚麻醉4 h會(huì)造成海馬功能長(zhǎng)期損害，影響記憶功能，這與王權(quán)等[15]研究結(jié)果一致。2.5%七氟醚對(duì)大鼠的運(yùn)動(dòng)能力無(wú)明顯損害。七氟醚可能通過(guò)作用于NMDA受體，引起行為異常和學(xué)習(xí)、記憶功能障礙的發(fā)生，具體的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，七氟醚麻醉可即刻造成幼鼠海馬組織NR2B、Caspase-3蛋白表達(dá)升高，成年海馬功能長(zhǎng)期損害，影響記憶功能。但成年后海馬組織NR2B、Caspase-3蛋白表達(dá)無(wú)明顯異常，值得進(jìn)一步研究。