李茜云, 郭 明*,, 董穎娜, 吳榮暉

(1.浙江農(nóng)林大學農(nóng)業(yè)與食品科學學院，浙江杭州 311300； 2.浙江農(nóng)林大學理學院，浙江杭州 311300)

料酒主要由黃酒基酒和香辛料組成。隨著人們生活水平的提高和食品行業(yè)的快速發(fā)展，料酒市場快速發(fā)展，市場上的調(diào)味料酒種類越來越多元化[1]。生產(chǎn)料酒主要是釀造方法和配制方法，市場上的料酒良莠不齊，雖有行業(yè)標準(SB/T 10416-2007)規(guī)范，但由于其中風味成分復(fù)雜，很難通過簡單的感官評定和一般分析來判定風味成分的質(zhì)量是否達標。目前國內(nèi)已有一些料酒鑒定新技術(shù)，如陳燕清等[2]利用小波變換-可見-近紅外技術(shù)來鑒別品牌料酒；李英等[3]采用電子舌、色度儀和高效液相色譜對料酒的品質(zhì)進行評價。這些技術(shù)方法對料酒的品牌鑒別和品質(zhì)評價具有重要的參考價值。

指紋圖譜技術(shù)能全面表征藥材內(nèi)在的化學成分種類和數(shù)量，被廣泛應(yīng)用于中草藥等復(fù)雜成分的鑒定及質(zhì)量評價。料酒為類似于中藥的復(fù)雜體系，既有黃酒醇、酯、醛類等成分[4]，又有香辛料中酚類、萜類等復(fù)雜成分[5,6]。應(yīng)用指紋圖譜技術(shù)可以全面反映料酒中的化學成分，提供豐富的鑒別信息，可有效對料酒的真實屬性及品質(zhì)進行評價[7]，具有綜合、宏觀、模糊的非線性特點[8 - 10]，但是基于實驗樣本量小、實驗條件和實驗設(shè)計有待優(yōu)化等條件限制，需要通過模式識別分析數(shù)據(jù)來驗證指紋圖譜構(gòu)建的可行性，結(jié)合化學計量學完善指紋圖譜體系以保證料酒的質(zhì)量品質(zhì)[11]。主成分分析和聚類分析為指紋圖研究中常見的兩種化學模式識別的方法，能以量化的形式對指紋圖譜的數(shù)據(jù)進行多維綜合的統(tǒng)計分析并實現(xiàn)樣本歸類，減少單個指標帶來樣本差異[12]。主成分分析[13]通過降維減少特征變量消除信息重疊，以較少互不相關(guān)的正交變量來表征料酒的多維信息[14]，但是考慮到主成分分析僅對貢獻率較大的成分進行統(tǒng)計分析，可能會存在信息缺失的問題，因此采用聚類分析作為佐證。聚類分析[15]能根據(jù)料酒數(shù)據(jù)源的相似性對其進行分類，相對于指紋圖譜和主成分分析更加簡單、直觀且不會造成數(shù)據(jù)缺失。本文采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析典型品牌料酒中醇、酯、萜等揮發(fā)性風味物質(zhì)成分，解析典型品牌料酒之間的共性，建立品牌料酒的指紋圖譜，并結(jié)合主成分分析和聚類分析從不同角度對料酒進行品牌分類和鑒別。所建立方法不僅適用于廠家自身產(chǎn)品的質(zhì)量評價[16 - 17]，而且還可為市場質(zhì)檢提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

6890N-5975B安捷倫氣/質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫科技有限公司)；MTN-2800W氮吹濃縮裝置(天津奧特賽恩斯)；KQ-250B超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；1810D自動雙重純水蒸餾器(上海申生科技有限公司)。

二氯甲烷(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；無水Na2SO4(分析純，上海虹光化工廠)。

14種典型品牌料酒樣品：購置10種市售浙江某典型品牌的不同類型料酒，分別為老酒料酒(5年)、蔥姜料酒Ⅰ、六年陳釀料酒、零添加料酒、蒸魚料酒、15°料酒、原釀五香料酒、蔥姜料酒Ⅱ、蔥姜料酒Ⅲ、料酒，按順序編碼為1～10號，這10種料酒用于建立標準指紋圖譜；購置4種市售不同批次的料酒，編碼11～14，利用建立的標準指紋圖譜評判這4種料酒的品質(zhì)。

1.2 實驗條件

1.2.1色譜條件色譜柱：Agilent HP-5毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；氦氣(99.999%)為載氣，恒定流速1.0 mL·min-1；進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，進樣體積1 μL；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持5 min；5 ℃·min-1升溫至60 ℃，保持2 min；4 ℃·min-1升溫至160 ℃，保持2 min；再以5 ℃·min-1升溫至250 ℃，保持3 min。

1.2.2質(zhì)譜條件電子轟擊離子源(EI)，離子源溫度230 ℃，電離能量70 eV，全掃描模式采集數(shù)據(jù)，掃描范圍為40～500 amu。

1.2.3樣品處理取10 mL料酒試樣于50 mL具塞玻璃管，加入二氯甲烷25 mL，超聲萃取20 min，經(jīng)分液漏斗得料酒有機相，重復(fù)提取兩次后合并。4 ℃條件下經(jīng)氮氣吹掃濃縮到5 mL后，加入無水Na2SO4，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1共有峰的選擇將10種典型品牌的料酒導入到《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》中，設(shè)置S1為參照峰，根據(jù)各個成分相對保留時間的一致性進行峰匹配，以多點校正消除各圖譜的時間誤差，自動匹配后得到共有峰，并以平均數(shù)法生成對照指紋圖譜。

1.3.2相似度評價將生成的對照指紋圖譜與典型品牌料酒的內(nèi)在共有峰進行相似性計算，以判斷料酒質(zhì)量的穩(wěn)定性和差異性。其中，夾角余弦法和相關(guān)系數(shù)法的計算如公式(1)和(2)所示。

(1)

式中：q為夾角余弦值；xKj、xLj為樣品K、L的第j個變量數(shù)據(jù)，j取1，2，…，p；p為變量數(shù)。

(2)

1.3.3化學計量學的數(shù)據(jù)分析基于14種料酒的492個所有色譜峰面積的樣本數(shù)據(jù)：運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行主成分降維，得到相關(guān)矩陣的方差貢獻率以及主成分的得分；運用SPSS 19.0進行系統(tǒng)聚類，以得到其樹狀圖。運用Origin 9.0對主成分得分作三維散點圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學考察

將樣品按1.2.3項下方法處理后，連續(xù)進樣5次。以保留時間為18.859 min的峰作為參照峰，計算得到共有峰相對保留時間的相對標準偏差(RSD)<0.54%，相對峰面積的RSD<2.7%，表明檢測系統(tǒng)的進樣精密度良好；將樣品按1.2.3項下方法處理后，分別在0、4、12、18、24 h依次進行檢測。以保留時間為18.859 min的峰作為參照峰，計算得到共有峰相對保留時間的RSD<0.18%，相對峰面積的RSD<2.3%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定；將樣品按1.2.3項下方法處理5份，進樣5次。以保留時間為18.859 min的峰作為參照峰，計算得到共有峰相對保留時間的RSD<0.15%，相對峰面積的RSD<0.2%，表明其重復(fù)性試驗較好。

2.2 10種典型品牌料酒指紋圖譜的建立

將10種某典型品牌料酒按1.2.3項下方法處理后，Origin軟件中1～10號10種典型品牌料酒的總離子流色譜圖如圖1所示。由圖1可知，在59 min內(nèi)，總出峰300多個，色譜峰較多，各個峰得到很好的分離，峰面積較大，峰形較好。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)共提取確定29個共有峰，經(jīng)NIST 08 標準質(zhì)譜圖庫檢索以及人工圖譜解析(匹配度≤80%)，再結(jié)合相關(guān)文獻，對各組分進行鑒定，確定影響此料酒的風味成分為醇、酯、醛、酚、烷、有機酸等化合物。鑒定的典型品牌料酒共有峰的詳細信息如表1所示。

圖1 10種典型品牌料酒總離子流(TIC)色譜圖 Fig.1 TIC chromatograms of 10 kinds of cooking wine of typical brand The serial number(1-29)of 29 common peaks are the same as those table 1.

表1 典型品牌料酒指紋圖譜共有峰組分分析結(jié)果

(續(xù)表1)

由表1可知，典型品牌料酒的29個共有峰的成分有醇類6種，酯類10種，脂肪酸2種，醛類2種，酰胺3種，酚類物質(zhì)2種，酮類物質(zhì)1種，雜烷物質(zhì)2種，萜類物質(zhì)1種。除黃酒的特征風味成分苯乙醇外，含量較高的有十二醛二甲縮醛(1.46%～6.941%)、琥珀酸單乙酯(1.77%～11.19%)、D-焦谷氨酸叔丁酯(0.60%～8.14%)和棕櫚酸(2.26%～4.68%)。典型品牌料酒主要揮發(fā)性風味成分是黃酒基酒發(fā)酵過程中有機酸與醇類物質(zhì)通過酵母酯化酶酯化作用生成的酯類物質(zhì)[18]和醛類物質(zhì)。棕櫚酸來自釀造過程中谷氨酸等氨基酸成分發(fā)酵產(chǎn)酸期生產(chǎn)的細胞膜脂肪酸[19]或是典型品牌料酒中添加的八角、丁香等香辛料的成分[20]。典型品牌料酒中檢測到的單萜烯物質(zhì)除冰片(龍腦)、α-松油醇外，還有桉葉油素、γ-萜品醇等，γ-萜品醇為姜的主要成分[21]；月桂、花椒、姜等多種香料中均含有桉葉油素[22-24]。

2.3 指紋圖譜特征峰的相對保留時間和相對峰面積

比較共有峰，選定峰面積較大的(共有峰占總峰面積大于0.5%)13個共有峰作為指紋圖譜特征峰，苯乙醇作參照峰，將其保留時間和峰面積設(shè)定為1.0，計算其它特征峰的相對保留時間和相對峰面積。10種典型品牌料酒特征峰的相對保留時間和相對峰面積如表2所示。

表2 10種典型品牌料酒指紋圖譜特征峰的相對保留時間和相對峰面積

Note:S1～S10 are the GC-MS fingerprint of 10 kinds of cooking wine of typical brand；R is the standard fingerprint；(*)is the relative peak area,which is different from the relative retention time.

2.4 10種典型品牌料酒指紋圖譜相似度分析

10種典型品牌料酒指紋圖譜相似度分析，計算結(jié)果如表3所示。

表3 10種典型品牌料酒GC-MS指紋圖譜相似度計算結(jié)果

由表3可知，典型品牌料酒10個樣品的相關(guān)系數(shù)法和向量余弦夾角法的數(shù)值均≤0.9400，說明該品牌不同種類的料酒具有較好的相似性，表明這10種料酒的風味成分一致性較好，技術(shù)指標穩(wěn)定，能綜合、準確地反映典型品牌料酒的風味情況?？梢宰鳛榕卸ㄔ摰湫推放屏暇频臉藴?。

2.5 典型品牌料酒標準指紋圖譜的品牌鑒別

為了驗證指紋圖譜的合理性和應(yīng)用性。將4種未知品牌的料酒按1.2.3方法處理后，得到的譜圖和數(shù)據(jù)同標準指紋圖譜的峰形和特征峰的相似度數(shù)據(jù)比對，判定4種不詳廠家和品牌的料酒品牌和質(zhì)量盲評。結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，從峰的總數(shù)與峰面積可看出，13號樣品的峰面積和峰的數(shù)目與標準樣品比較相似，11、12和14號樣品的峰的數(shù)目與峰面積與標準指紋圖譜存在一定差異。

圖2 4種料酒與標準指紋圖譜的色譜圖對比 Fig.2 Comparison of chromatograms of 4 kinds of cooking wine with standard fingerprint The serial number(1-29)of 29 common peaks are the same as those table 1.

圖3 前三個主成分的3D得分圖Fig.3 3D scores of the first three principal components

對標準指紋圖譜與4種料酒的特征峰采用夾角余弦法和相關(guān)系數(shù)法進行計算，13號樣品的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)為0.9947和0.9911，高于閾值0.9400，證實為該品牌的料酒。11號樣品的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)僅為0.5504和0.0123，12號樣品的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)為0.4843和0.2017，14號樣品的夾角余弦和相關(guān)系數(shù)為0.4093和-0.0549，3個檢測樣品均遠遠低于閾值0.9400，鑒別不是該典型品牌的料酒。這與指紋圖譜的判定結(jié)果完全相符。

2.6 14種料酒主成分分析的品牌鑒別和分類

將14種料酒通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)的匹配數(shù)據(jù)后，按照保留時間將樣品所有峰面積列出，沒有的色譜峰的峰面積為0，共得到492個所有色譜峰的相對峰面積。運用SPSS 19.0以所有色譜峰面積為變量進行主成分總體分析，通過降維[25]來弱化變量間自相關(guān)性引起的誤差從而得到互不相關(guān)的主成分的特征值、貢獻率、累計貢獻率[26]以及得分，從而實現(xiàn)對料酒品質(zhì)的綜合評價。降維得到的前3個主成分(累積貢獻率53.43%)的得分在三維空間的投影情況如圖3所示。

圖3可將這14種料酒分為2類，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、13為一類，11、12、14為另一類。即主成分分析和指紋圖譜的檢測結(jié)果一致。

圖4 14種料酒聚類分析譜系圖Fig.4 Cluster analysis spectrum map of 14 kinds of cooking wine

2.7 14種料酒聚類分析的品牌鑒別和分類

以492個所有峰的相對峰面積為變量，運用SPSS 19.0軟件以余弦距離為度量標準，采用組間連接的方法對14個樣品進行聚類分析，再次對料酒進行品牌驗證。其結(jié)果如圖4所示。從圖4譜系圖可見，14種料酒在類間間距D=12.5時，14種料酒大致可以分為4類。第一類為3、7、8、1、4、2、10、9、5、6、13，第二類為11，第三類為12，第四類為14。以上結(jié)果驗證了指紋圖譜相似度的計算結(jié)果和主成分的計算結(jié)果，即10種典型品牌料酒和13為相同品牌，其他三種料酒不屬該品牌料酒。由此也驗證了指紋圖譜和主成分分析的合理性。

3 結(jié)論

采用品牌料酒標準指紋圖譜共有峰成分來確定料酒的風味物質(zhì)，計算特征峰組的相似度均達到了0.9400以上，說明標準指紋圖譜的色譜圖和數(shù)據(jù)可以作為典型品牌料酒的質(zhì)量分析與鑒別的依據(jù)。中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)能夠分析影響料酒的風味成分，主成分分析和聚類分析可以對品牌進行鑒定和分類，且主成分分析和聚類分析即使在共有峰很少或沒有共有峰的情況下，仍可以判別酒的真?zhèn)尾⒎诸悺?種方法相互印證、相互補充，使品牌鑒別和質(zhì)量評價更加可靠、更加全面、更加科學。