王 瑞， 徐 軍， 張瑞良， 王文靜， 王 磊, 趙 霞， 楊艷菲， 李 琳*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036)

喹諾酮類(lèi)藥物(QNs)是于20世紀(jì)60年代出現(xiàn)的一類(lèi)人工合成抗菌藥，主要通過(guò)抑制細(xì)菌DNA復(fù)制而發(fā)揮抗菌作用，具有抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)、口服吸收好、使用方便、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。隨著QNs在臨床上的不合理或過(guò)量使用，易引起潛在的致癌、致畸、致突變作用，其在環(huán)境中的殘留問(wèn)題也越來(lái)越顯著[1 - 3]。基于環(huán)境與消費(fèi)者安全考慮，歐盟、美國(guó)食品藥物管理局和中國(guó)農(nóng)業(yè)部[4 - 6]等都制定了QNs在動(dòng)物源性食品中的最高殘留限量(MRL)。因此，加強(qiáng)對(duì)QNs的殘留監(jiān)測(cè)，建立快速、靈敏、可靠的定量檢測(cè)方法非常必要。

雞肉樣品基質(zhì)復(fù)雜，低濃度的目標(biāo)物易被干擾，導(dǎo)致提取和凈化不徹底，因此對(duì)樣品前處理技術(shù)要求較高。固相萃取[7 - 8]是常用的樣品前處理方法。傳統(tǒng)固相萃取的目標(biāo)物與吸附劑之間是非特異性的，填料選擇性不強(qiáng)，常發(fā)生與雜質(zhì)共萃取的現(xiàn)象，影響后續(xù)分析[9 - 10]。而分子印跡固相萃取(MISPE)是以高選擇性的分子印跡聚合物(MIPs)為固相萃取填料，MIPs具有選擇性地分離復(fù)雜樣品中的痕量分析物、有效去除雜質(zhì)干擾、提高分析的準(zhǔn)確度和靈敏度、穩(wěn)定性好、能夠重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)[11 - 13]。Tang等[14]采用MISPE技術(shù)，以恩諾沙星為模板合成中空的MIPs，能夠有效去除復(fù)雜基質(zhì)干擾，靈敏度高。Urraca等[15]建立MISPE-LC-MS/MS法僅對(duì)雞肉中環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、沙拉沙星、洛美沙星、單諾沙星6種QNs進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。本文選取了16種典型的喹諾酮類(lèi)藥物作為研究對(duì)象，通過(guò)優(yōu)化MISPE條件，建立了一種基于MISPE-UPLC-MS/MS快速測(cè)定雞肉中喹諾酮類(lèi)藥物殘留的分析方法，可應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，為相關(guān)藥物的快速檢測(cè)提供重要參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Acquity UPLC-Xevo TQ MS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀及固相萃取裝置(美國(guó)，Waters公司)；SupelMIPTM-SPE(25 mg/3mL，美國(guó)Sigma公司)；GHP針式濾膜(0.22 μm，美國(guó)Pall公司)。

氧氟沙星(Ofloxacin，純度99%)、諾氟沙星(Norfloxacin，純度99%)、培氟沙星(Pefloxacin，純度99%)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，純度99%)、洛美沙星(Lomefloxacin，純度97%)、恩諾沙星(Enrofluxacin，純度99%)、達(dá)氟沙星(Danofloxacin，純度93%)、沙拉沙星(Sarafloxacin，純度97%)、二氟沙星(Difluoxacin，純度98%)、吡哌酸(Pipemidic Acid，純度99%)、麻保沙星(Marbofloxacin，純度99%)、依諾沙星(Enoxacin，純度99%)、氟羅沙星(Fleroxacin，純度99%)、奧比沙星(Orbifloxacin，純度99%)、惡喹酸(Oxolinic acid，純度98%)、吡咯酸(Piromidic acid，純度98%)均購(gòu)自于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。尤利沙星(Ulifloxacin，純度95%)、加替沙星(Gatifloxacin，純度98%)均購(gòu)自于加拿大Toronto Research Chemicals公司。乙酰丙嗪(Acepromazine，純度98%)、甲苯噻嗪(Xylazine，純度98%)、甲氧芐啶(Trimethoprim，純度98%)、磺胺間甲氧芐啶(Sulfamamonomethoxine，純度98%)、磺胺對(duì)甲氧嘧啶(Sulfameter，純度98%)、泰樂(lè)菌素(Tylosin，純度98%)、麥迪霉素(Midecamycin，純度98%)、羅紅霉素(Roxithromycin，純度98%)、紅霉素(Erythromycin，純度98%)均購(gòu)自于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司?；前废醣?Sulfanitrn，純度98%)、磺胺噻唑(Sulfathiazole，純度98%)、吉他霉素(Stereomycin，純度98%)、萘啶酸(Nalidixic acid，純度98%)、氟甲喹(Flumequine，純度98%)均購(gòu)自于美國(guó)U.S.Pharmacopeia公司。甲醇、乙腈均為色譜純(德國(guó)CNW科技公司)；甲酸為色譜純(北京迪馬科技有限公司)；乙酸、氨水為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取上述16種喹諾酮類(lèi)藥物的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并配制質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃的冰箱中冷藏保存；使用時(shí)依次用水稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度，根據(jù)需要用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋?zhuān)渲七m當(dāng)質(zhì)量濃度的16種喹諾酮類(lèi)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，且現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 液相色譜條件

Acquity LC BEH C18柱(100×2.1 mm，1.7 μm,美國(guó)Waters公司)；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5.0 μL；流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脫程序:0～2 min，10%B；2～3 min，10%～15%B；3～4 min，15%～55%B；4～5 min，55%～80%B；5～5.5 min，80%～10%B；5.5～7 min，10%B。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子模式(ESI+)；質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)檢測(cè)；毛細(xì)管電壓2 700 V；離子源溫度150 ℃；霧化氣流量1 000 L/h；錐孔氣流量50 L/h；碰撞氣流量0.24 L/h；霧化室溫度450 ℃。采集參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 保留時(shí)間與質(zhì)譜參數(shù)

(續(xù)表1)

*Quantitative ion.

1.5 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g均質(zhì)后的雞肉樣品，置于50 mL離心管中，加入8 mL 0.5 mol/L KH2PO4溶液，以8 000 r/min離心5 min，收集上清于50 mL離心管中，用8 mL溶液重復(fù)提取一次，合并提取液。MISPE柱經(jīng)2 mL甲醇、2 mL水活化后，加入4 mL提取液，經(jīng)2 mL水、2 mL乙腈、2 mL 2%乙酸乙腈、2 mL 0.1%氨水溶液淋洗，3 mL 5%氨化甲醇溶液洗脫，在優(yōu)化條件下進(jìn)行凈化，收集洗脫液，于40 ℃下氮?dú)獯抵两?，? mL 0.1%甲酸-乙腈(體積比9∶1)溶解殘留物，過(guò)0.22 μm濾膜，供UPLC-MS/MS檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 MISPE柱凈化條件的優(yōu)化

2.1.1上樣液體積的選擇本實(shí)驗(yàn)對(duì)上樣液的體積進(jìn)行了研究。稱(chēng)取2 g空白雞肉樣品，添加10 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別以體積為4 mL、8 mL、16 mL的提取液上樣，通過(guò)UPLC-MS/MS測(cè)定各藥物的回收率。當(dāng)上樣體積為16 mL時(shí)，各藥物的回收率最低，在45.9%～85.8%之間；而當(dāng)上樣體積為4 mL和8 mL時(shí)，回收率在70.4%～110.5%和60.3%～110.4%，均滿(mǎn)足藥物殘留檢測(cè)要求。由于雞肉樣品經(jīng)磷酸鹽溶液提取后，樣品溶液中含有一定的雜質(zhì)，且隨著上樣體積的增加，而基質(zhì)效應(yīng)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響，導(dǎo)致后續(xù)凈化不徹底[16]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇4 mL提取液作為上樣溶液。

2.1.2淋洗和洗脫條件的選擇為了保證MISPE柱的最優(yōu)效果，本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)比較了不同比例氨水溶液、乙酸乙腈、氨化甲醇溶液對(duì)16種QNs的淋洗與洗脫特征。對(duì)MISPE進(jìn)行淋洗時(shí)，2%乙酸乙腈、0.1%氨水洗脫能力較弱，對(duì)于各藥物的淋洗率均低于5%；5%乙酸乙腈、0.5%氨水、2%氨化甲醇洗脫能力逐漸增強(qiáng)，藥物的淋洗率分別為23.8%～44.4%、33.1%～53.7%、58.4%～69.1%；5%氨化甲醇洗脫能力最強(qiáng)，各藥物的淋洗率均高于72.3%；樣品流經(jīng)MISPE柱后，先用水淋洗，可有效去除樣品中極性較大的雜質(zhì)，以降低對(duì)MS/MS檢測(cè)中的基質(zhì)效應(yīng)。不僅要考慮淋洗液能夠洗掉柱子上的雜質(zhì)、干擾物及提高M(jìn)ISPE柱子的選擇性，同時(shí)還要保證回收率的要求，所以本實(shí)驗(yàn)最終選擇水、乙腈、2%乙酸乙腈、0.1%氨水為淋洗條件。

2.1.3洗脫液體積的選擇本實(shí)驗(yàn)研究了不同體積(2～5 mL)的洗脫液對(duì)16種喹諾酮類(lèi)藥物回收率的影響。當(dāng)洗脫液的體積由2 mL增加至3 mL時(shí)，喹諾酮類(lèi)各藥物的回收率均有所提高；當(dāng)洗脫液體積為3 mL時(shí)，回收率為84.3%～105.9%，各藥物的都能夠獲得較高的回收率。當(dāng)洗脫液的體積由3 mL增加至5 mL時(shí)，各藥物的回收率均呈下降趨勢(shì)。為了達(dá)到理想的回收率，又減少洗脫溶液中的雜質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)最終選擇洗脫液的體積為3 mL。

2.2 MISPE柱吸附特性的測(cè)定

2.2.1MISPE柱對(duì)于不同類(lèi)藥物的吸附選擇性分別將含有2種鎮(zhèn)靜劑(乙酰丙嗪、甲苯噻嗪)、5種磺胺類(lèi)(磺胺間甲氧芐啶、磺胺硝苯、磺胺噻唑、甲氧芐啶、磺胺對(duì)甲氧芐啶)、5種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)(泰樂(lè)菌素、麥迪霉素、羅紅霉素、紅霉素、吉他霉素)及16種目標(biāo)分析物的KH2PO4溶液加入MISPE柱，依次用水、乙腈、2%乙酸乙腈、0.1%氨水溶液對(duì)MISPE柱進(jìn)行淋洗及5%氨化甲醇進(jìn)行洗脫，并且收集上樣液、淋洗和洗脫液，測(cè)定各藥物的回收率。由表2可見(jiàn)，上樣液經(jīng)MISPE柱后，鎮(zhèn)靜劑、磺胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)不能被有效保留，有20.5%～77.5%直接流出；經(jīng)水、乙腈、2%乙酸乙腈、0.1%氨水溶液淋洗后，殘留的非目標(biāo)物均被淋洗下來(lái)，而目標(biāo)物的回收率極低；當(dāng)采用5%氨化甲醇洗脫時(shí)，僅16種QNs被洗脫，未發(fā)現(xiàn)非目標(biāo)物。其原因可能是鎮(zhèn)靜劑、磺胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與QNs藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)相差較大，不易與MIPs重模板相互作用與結(jié)合，因而在上樣、淋洗過(guò)程中就直接被淋洗下來(lái)。

表2 2種鎮(zhèn)靜劑、5種磺胺和5種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物在上樣、不同淋洗和洗脫條件下的回收率

"-"：non detection.

2.2.2MISPE柱對(duì)于QNs的吸附選擇性實(shí)驗(yàn)研究了MISPE柱對(duì)于喹諾酮此類(lèi)藥物的吸附選擇性。將含有16種目標(biāo)分析物和4種喹諾酮類(lèi)藥物(氟甲喹、惡喹酸、萘啶酸、吡咯酸)的KH2PO4溶液加入MISPE柱，同上述操作。由表3可見(jiàn)，上樣液流經(jīng)MISPE柱后，所有的藥物被有效的保留在MISPE柱上；4種QNs經(jīng)淋洗操作后，均在乙腈處被大量的洗脫下來(lái)，且各藥物的淋洗率均在80%以上，而16種目標(biāo)物的回收率極低；當(dāng)采用5%氨化甲醇洗脫時(shí)，僅16種QNs目標(biāo)分析物被洗脫，未發(fā)現(xiàn)其他4種QNs。林峰等[17]報(bào)道了脫羧峰是喹諾酮分子含有羧基基團(tuán)的表征，脫羧后哌嗪環(huán)斷裂重排更是喹諾酮藥物特有的

表3 4種喹諾酮類(lèi)藥物在上樣、不同淋洗和洗脫條件下的回收率

"-"：non detection.

結(jié)構(gòu)表征。4種喹諾酮類(lèi)藥物流經(jīng)MISPE柱后可以被有效的保留在柱上的原因可能是它們與16種目標(biāo)物的側(cè)鏈上均含有羧基，其能夠與MIPs上位點(diǎn)相結(jié)合；但經(jīng)水和乙腈淋洗后，又被大量洗脫下來(lái)的原因可能為這種結(jié)合能力較弱，可以視為無(wú)特異性吸附；推測(cè)可能是由于4種喹諾酮類(lèi)藥物不具有哌嗪等含氮堿基活性官能團(tuán)；而16種目標(biāo)分析物側(cè)鏈上的這種活性官能團(tuán)是其與MIPs發(fā)生特異性結(jié)合位點(diǎn)。

2.3 MISPE凈化雞肉中QNS殘留-UPLC-MS/MS檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

采用空白基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，真實(shí)反映樣品中喹諾酮類(lèi)藥物的含量。用質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200 μg/L的16種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析，以待測(cè)物的定量離子峰面積(Y)作為縱坐標(biāo)，以待測(cè)物的質(zhì)量濃度(X)作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各藥物在0.25～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均>0.99。以3倍信噪比(S/N)為檢出限、10倍信噪比為定量限，16種喹諾酮類(lèi)藥物的檢出限與定量限分別為0.08 μg/kg和0.25 μg/kg。

在雞肉樣品中添加0.25、2.5、5.0 μg/kg 3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每個(gè)水平做6個(gè)平行試驗(yàn)，重復(fù)3次。平均回收率為88.6%～101.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.9%～10.5%。16種喹諾酮類(lèi)藥物的回歸方程與相關(guān)系數(shù)、添加回收率與精密度見(jiàn)表4。

表4 雞肉樣品中16種喹諾酮類(lèi)藥物的回歸方程與相關(guān)系數(shù)、添加回收率與精密度

(續(xù)表4)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

本研究在空白雞肉樣品中添加不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各藥物的峰面積對(duì)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，MISPE柱富集凈化的雞肉組織中16種喹諾酮類(lèi)藥物，各藥物的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比為81.9%～108.5%。表明，樣品經(jīng)MISPE柱凈化后，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)分析結(jié)果無(wú)明顯影響。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

本研究建立的方法對(duì)安徽省某屠宰場(chǎng)采集的80份雞肉樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，有3份雞肉樣品中含有諾氟沙星。檢測(cè)出的殘留值為3.37、4.42和6.55 μg/kg。和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 20366-2006)[18]方法檢測(cè)結(jié)果基本一致，且本方法選擇性更好、靈敏度更高。

3 結(jié)論

建立了MISPE-UPLC-MS/MS測(cè)定雞肉中16種QNs殘留的方法，同時(shí)優(yōu)化了萃取條件，使得所有藥物得到了良好的分離，有效降低了基質(zhì)效應(yīng)，提高了方法的選擇性，并且操作簡(jiǎn)單、靈敏度高。