張歡，何麗麗

（1.湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 藥學部，湖北 武漢 430015；2.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023）

牡丹皮、赤芍均為毛茛科植物，化學成分類似[1]。牡丹皮具有清熱涼血、活血化瘀的功效，赤芍具有活血散瘀、止痛的功效，臨床常相須為用，協(xié)同增效，為活血化瘀常用藥對，如《金匱要略》中“溫經(jīng)湯”[2]、《外科正宗》之“活血散瘀湯”[3]、《備急千金要方》之“犀角地黃湯”[4]。但該藥對配伍活血化瘀療效及有效成分的變化研究少見報道。本文依據(jù)該藥對的臨床用藥特點，以水煎湯劑為主要研究對象，考察兩藥配伍對家兔體外血小板聚集抑制率、體外凝血酶時間等活血化瘀藥效指標的影響。同時，測定兩藥配伍后沒食子酸、芍藥苷、丹皮酚的含量變化。從生物效應(yīng)及物質(zhì)基礎(chǔ)兩方面研究該藥對配伍的變化，初步探究其用藥合理性，為臨床用藥提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 牡丹皮、赤芍（武漢天濟飲片公司），經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學詹亞華教授鑒定分別為毛茛科植物牡丹（paeonia suffruticosa andr）的干燥根皮、毛茛科植物川赤芍（paeonia veitchii lynch）的干燥根。沒食子酸、丹皮酚、芍藥苷購自中國食品藥品檢定研究院，腺苷二磷酸（ADP）購自北京中勤世帝科學儀器公司，枸櫞酸鈉購自國藥集團化學試劑公司，牛凝血酶購自美國Sigma 公司，乙腈、甲醇購自美國Teddia 公司。

1.1.2 儀器 Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher 公司），BS124S 型電子天平（德國Sartorius 公司），KQ-250E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Milli-Q 超純水機（美國Millipore公司），BE COMPACT X 全自動血凝檢測儀（德國BE公司），DM0412 型離心機（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司），移液器（德國Eppendorf 公司）。

1.1.3 動物 健康新西蘭大耳白家兔，雄性，體重2.0 ～2.5 kg，由華中科技大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（鄂）2016-0009。

1.2 各組供試品溶液的制備

1.2.1 牡丹皮組供試品溶液的制備 稱取牡丹皮20 g，加10 倍量的水，浸泡1 h，置于電爐上直火煎煮3 次，每次40 min。合并3 次濾液，過濾，濃縮至100 ml，0.45 μm 有機微孔濾膜濾過，即得0.2 g/ml 的牡丹皮濃縮液，臨用時加水稀釋至0.1 g/ml，即得0.1 g/ml的牡丹皮組供試品溶液。

1.2.2 赤芍組供試品溶液的制備 同牡丹皮組供試品溶液的制備方法，制備0.1 g/ml 的赤芍組供試品溶液。

1.2.3 牡丹皮、赤芍合煎組供試品溶液的制備 分別稱取牡丹皮、赤芍各20 g，同按牡丹皮組供試品溶液的制備方法，制備0.2 g/ml 的牡丹皮、赤芍合煎組供試品溶液。

1.2.4 牡丹皮、赤芍單煎再混合組供試品溶液的制備 分別精密移取10 ml 的牡丹皮、赤芍濃縮液，混合均勻，濃縮后加水定容至10 ml，即為0.2 g/ml 的牡丹皮、赤芍單煎再混合組供試品溶液。

1.2.5 混合對照品溶液的配制 分別精密稱取沒食子酸、芍藥苷、丹皮酚對照品0.00210、0.00184 和0.00163 g，于10 ml 容量瓶中，加甲醇定容，混勻，即得混合對照品溶液。其中沒食子酸、芍藥苷、丹皮酚的濃度分別為210、184 和163 μg/ml。

1.3 各組活血作用檢測

1.3.1 對ADP 誘導(dǎo)家兔體外血小板聚集的影響 家兔頸總動脈取血4.5 ml，加至含有38 g/L 枸櫞酸鈉0.5 ml 的離心管中，混勻。另取肝素鈉抗凝血5 ml。每次均采集6 個樣本，室溫下，將新鮮全血1 000 r/min離心10 min，取上層液，即為富血小板血漿（platelet rich plasma,PRP）；剩余部分以3 000 r/min 離心10 min，取上清液，即為貧血小板血漿（platelet poor plasma,PPP）。 采用血小板聚集儀進行血小板聚集功能測定，以純凈水為空白對照組，PPP 調(diào)零。測定時分別取各組供試品溶液100 μl 與150 μl PRP 在37℃比濁杯內(nèi)孵育3 min，加攪拌珠，分別加入誘導(dǎo)劑ADP 10 μl 誘導(dǎo)血小板聚集，此時，牡丹皮組、赤芍組、合煎組、單煎再混合組的藥液終濃度分別為40、40、80 及80 mg/ml，測試并記錄6 min 內(nèi)最大聚集率。

1.3.2 對血漿凝血酶時間的檢測 測試杯通道中加入100 μl PPP 和各樣品溶液80 μl，37℃溫育3 min，再加入已預(yù)溫的1.5×104u/L 凝血酶20 μl，混勻，此時，牡丹皮組、赤芍組、合煎組、單煎再混合組的藥液終濃度分別為40、40、80 及80 mg/ml，用血小板聚集凝血因子分析儀測定凝血時間。對照組加100 μl 純凈水，每組重復(fù)6 次，取平均值，記錄各組凝血時間。

1.4 各組化瘀作用檢測

1.4.1 對血栓溶解的檢測 取家兔枸櫞酸鈉抗凝血10 ml，然后依次加入200 μl 0.5%纖維蛋白原溶液、100 μl 50 g/L 氯化鈣CaCl2溶液、200 μl 1.0×105u/L 凝血酶溶液。混勻，注入平底玻璃試管中，37℃水浴20 min 后取出血栓，切成0.5 cm 的小段，放入裝有2 ml不同質(zhì)量的藥液中，對照組為2 ml 的純凈水，37℃溫育，于0、6、12、24、48 h 分別測定剩余血栓段的質(zhì)量，按照公式計算血栓溶解率：血栓溶解率=（血栓初始質(zhì)量-藥物作用后各時間點血栓質(zhì)量）/血栓初始質(zhì)量，各給藥組平行測定6 次。

1.4.2 對全血凝塊溶解的檢測 家兔采血20 ml 置于表面皿中，2 h 后自然凝固后切成0.5 cm×0.5 cm× 0.5 cm 的小塊，用生理鹽水沖洗3 次，待用。將不同質(zhì)量濃度的藥液各2 ml 加入15 ml EP 管中，加純凈水至5 ml，對照組加5 ml 的純凈水，此時，牡丹皮組、赤芍組、合煎組、單煎再混合組的藥液終濃度分別為40、40、80 及80 mg/ml，向各裝有藥液的EP 管中加入6 個血塊，37℃溫育，于0、6、12、24、48 h 分別測定血塊的質(zhì)量，按照公式計算全血凝塊溶解率：全血凝塊溶解率=（血凝塊初始質(zhì)量-藥物作用后各時間點血凝塊質(zhì)量）/血凝塊初始質(zhì)量。

1.5 沒食子酸、芍藥苷、丹皮酚的含量測定

色譜條件：色譜柱：AcclaimTM120（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（1 ～6 min，10% A；6 ～20 min，10%～ 14% A；20 ～30 min，14%～35% A；30 ～40 min，35% A）；流速：1 ml/min；柱溫：25℃；檢測波長：230 nm；進樣量：10 μl。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組不同時間點的比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，兩兩間比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 牡丹皮、赤芍配伍前后活血作用比較

2.1.1 對家兔體外血小板聚集的影響 空白對照組的血小板最大聚集率為42.62%，給予不同藥液后，各組血小板最大聚集率均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中，牡丹皮組下降至24.84%，赤芍組下降至27.03%，合煎組的體外血小板聚集率為20.77%，單煎再混合組下降至23.45%。結(jié)果顯示兩藥合煎能抑制家兔體外血小板聚集。見表1。

2.1.2 對血漿凝血酶時間的影響 空白對照組的家兔體外血漿凝血酶時間為13.45 s，加入各組藥液后凝血酶時間均上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中牡丹皮上升至17.32 s，赤芍組上升至18.94 s，合煎組上升最高，為21.01 s，單煎再混合組為19.87 s。結(jié)果顯示兩藥合煎后，血漿凝血酶時間增加。見表1。

表1 家兔體外血小板最大聚集率和血漿凝血酶時間比較 （±s）

表1 家兔體外血小板最大聚集率和血漿凝血酶時間比較 （±s）

注：?與空白對照組比較，P ＜0.05

組別 濃度/ （mg/ml）血小板最大 聚集率/%血漿凝血酶 時間/s空白對照組 - 42.62±1.08 13.45±1.94牡丹皮組 40 24.84±2.16? 17.32±1.57?赤芍組 40 27.03±1.52? 18.94±3.51?合煎組 80 20.77±1.98? 21.01±1.68?單煎再混合組 80 23.45±2.11? 19.87±3.87?F 值 511.22 94.95 P 值 0.000 0.000

2.2 各組化瘀作用比較

2.2.1 對血栓溶解的影響 給藥組與空白對照組在6、12、24、48 h 血栓溶解率的比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的血栓溶解率有差異（F=1 344.74，P=0.000）；②各組血栓溶解率有差異（F=1 989.56，P=0.000）；③各組血栓溶解率變化趨勢有差異（F=1 182.02，P=0.000）。各給藥組均能促進體外血栓溶解，且與時間呈依賴性遞增。48 h后，各給藥組血栓溶解率幾乎持平。見表2。

2.2.2 對全血凝塊溶解的影響 各組在6、12、24、48 h 全血凝塊溶解率的比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的全血凝塊溶解率有差異（F=1 254.15，P=0.000）；②各組血栓溶解率有差異（F=1 756.69，P=0.000）；③各組血栓溶解率變化趨勢有差異（F=1 021.54，P=0.000）。各給藥組均能促進家兔體外全血凝塊溶解，且與時間呈依賴性遞增。48 h 后，各組全血凝塊溶解率幾乎持平。見表3。

表2 各組體外血栓溶解率的比較 （±s）

表2 各組體外血栓溶解率的比較 （±s）

注：?與空白對照組比較，P ＜0.05

組別 濃度/（mg/ml）血栓溶解率/%6 h 12 h 24 h 48 h空白對照組 - 16.12±3.18 23.12±1.06 41.58±4.27 64.13±1.85牡丹皮組 40 18.43±2.14? 29.77±3.16? 51.99±1.64? 74.54±3.51?赤芍組 40 20.52±3.30? 31.43±2.65? 57.01±2.46? 75.03±2.63?合煎組 80 29.01±4.61? 45.76±3.66? 70.68±2.96? 76.11±3.26?單煎再混合組 80 27.65±2.11? 43.51±4.10? 65.87±4.31? 75.82±3.68?

表3 各組全血凝塊溶解率的比較 （±s）

表3 各組全血凝塊溶解率的比較 （±s）

注：?與空白對照組比較，P ＜0.05

組別 濃度/（mg/ml）全血凝塊溶解率/%6 h 12 h 24 h 48 h空白對照組 - 11.11±2.75 19.76±2.10 34.13±2.09 60.12±3.58牡丹皮組 40 20.16±1.64? 31.27±1.33? 56.55±2.23? 76.29±2.35?赤芍組 40 21.44±2.56? 33.03±2.61? 57.26±3.15? 77.51±3.01?合煎組 80 27.01±3.01? 48.46±2.35? 72.08±3.29? 80.13±4.21?單煎再混合組 80 25.25±1.51? 44.98±3.66? 70.84±1.52? 78.62±3.27?

2.3 沒食子酸、芍藥苷、丹皮酚的含量

混合對照品及各供試品圖譜見圖1，以各色譜峰峰面積（?）對質(zhì)量分數(shù)（X）進行線型回歸，各成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線型范圍見表4。根據(jù)各成分的標準曲線計算各供試品中各成分的含量，每個樣品重復(fù)測定3 次。兩兩比較采用LSD-t檢驗，結(jié)果表明，與牡丹皮組比較，赤芍組中沒食子酸含量降低、芍藥苷含量升高、丹皮酚含量升高（P＜0.05）。兩者合煎后，與單煎再混合組比較，合煎組芍藥苷含量增加（P＜0.05）、沒食子酸含量幾乎持平，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明兩者配伍對沒食子酸含量無明顯影響；丹皮酚含量在各組中均在較低水平。見表5。

圖1 混合對照品及各供試品溶液色譜圖

表4 3 種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線型范圍

表5 各組供試品溶液中3 種成分的含量 （±s）

表5 各組供試品溶液中3 種成分的含量 （±s）

注：1）與牡丹皮組比較，P ＜0.05；2）與單煎再混合組比較，P ＜0.05

組別質(zhì)量分數(shù)/（mg·g）沒食子酸 芍藥苷 丹皮酚牡丹皮組 13.23±2.31 9.63±4.23 3.06±0.65赤芍組 6.44±2.6011） 49.70±2.331） 5.95±0.821）合煎組 20.48±1.08 62.54±1.882） 7.69±1.77單煎再混合組 19.06±0.52 53.27±3.15 7.03±2.93 F 值 121.23 146.32 35.76 P 值 0.041 0.046 0.053

3 討論

中醫(yī)認為血瘀是因血液瘀滯所帶來的病癥，凡血液運行不暢或體內(nèi)離經(jīng)止血未能消散，都成為瘀血[5]。

血小板聚集是血液運行不暢的一個重要原因，ADP 誘導(dǎo)血小板凝集法較為成熟[6]。凝血酶時間是指在血漿中加入標準化的凝血酶后血液凝固的時間。這些指標可作為評價藥物活血功能的參考。實驗表明，牡丹皮與赤芍均能抑制ADP 誘導(dǎo)的血小板凝集，兩者配伍使用后抑制作用增強。說明牡丹皮、赤芍作為常用藥對，可協(xié)同增強活血作用，具有組方合理性。

離經(jīng)之血易形成血栓、血凝塊[7]，本實驗采用體外溶栓等實驗，考察牡丹皮、赤芍及其兩者配伍后的化瘀藥效。結(jié)果表明，牡丹皮、赤芍均可提高血栓溶解率及全凝血塊溶解率，且赤芍藥效優(yōu)于牡丹皮。兩藥配伍使用，溶栓及溶血療效優(yōu)于單獨使用，合煎藥液優(yōu)于單煎后再混合藥液。說明牡丹皮、赤芍配伍使用在化瘀作用方面具有合理性。

沒食子酸、芍藥苷、丹皮酚具有抗血小板聚集，溶解血栓的作用[8-10]，說明該成分與活血化瘀存在一定的聯(lián)系。含量測定結(jié)果可見：①沒食子酸含量：單煎再混合≤牡丹皮單煎+赤芍單煎≤合煎；②芍藥苷含量：單煎再混合＜牡丹皮單煎+赤芍單煎＜合煎；③丹皮酚含量：再混合＜合煎＜牡丹皮單煎+赤芍單煎。由此可見，合煎可以促進沒食子酸及芍藥苷的溶出。再混合后，芍藥苷含量降低，這可能是由于溶液微環(huán)境的變化導(dǎo)致芍藥苷水解所致。丹皮酚含量則始終較低，可能由于丹皮酚水溶性差、熔點低、易揮發(fā)、不穩(wěn)定等特點所致[11-12]。

藥對是中醫(yī)臨床實踐經(jīng)驗積累的結(jié)晶，是中醫(yī)辯證施治、遣方用藥的物質(zhì)基礎(chǔ)[13]。本研究分別從活血及化瘀兩方面，設(shè)計體外藥效實驗方法。同時建立HPLC 同時測定沒食子酸、芍藥苷、丹皮酚含量的方法。實驗結(jié)果表明，牡丹皮、赤芍藥對配伍合煎能促進有效成分的溶出，協(xié)同增強活血化瘀藥效，具有配伍合理性。該結(jié)果為深入闡明其配伍機制奠定一定的基礎(chǔ)，同時也為臨床合理用藥提供支持。