李莉鑫，任華偉 ，李藝?yán)?，冀云?，薛霖莉 ，曹 靖 ，羅小毛，于秀菊，赫曉燕，王海東

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，山西太谷030800；3.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京102442）

MyoG是螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）基因家族的一員，與 Myf5，MyoD1和MRF4等基因功能相似，都是生肌調(diào)節(jié)因子[1-3]。這些生肌調(diào)節(jié)因子不僅調(diào)控著肌纖維的生長(zhǎng)發(fā)育，而且也對(duì)肌肉的功能有間接影響。但多數(shù)研究都聚焦于骨骼肌中的MyoG基因，例如,在胚胎發(fā)育早期，MyoG對(duì)于骨骼肌的形成具有促進(jìn)作用[4-5]。MyoG基因的缺失還會(huì)引起小鼠骨骼肌發(fā)生萎縮，且嚴(yán)重時(shí)可能造成死亡[6]。骨骼肌中不斷發(fā)生著肌纖維的損傷與修復(fù)過程，MyoG是維持肌肉正常功能的重要參與者[7-8]。而關(guān)于心肌中MyoG的研究則相對(duì)比較少，有研究發(fā)現(xiàn)，MyoG在心肌中也有表達(dá)，但是表達(dá)量比較低，而且MyoG對(duì)心肌組織的發(fā)育起作用，間接調(diào)控心肌的發(fā)育[9]。引起心肌疾病的原因有很多，其中，MyoG基因有利于心肌發(fā)育，若其缺失將會(huì)限制發(fā)育或引起發(fā)育緩慢，甚至導(dǎo)致心肌衰亡。MyoG基因的深入研究不僅為理解骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育提供新的理論依據(jù)，而且對(duì)預(yù)防肌肉疾病具有重大意義[10]。

基于以往學(xué)者們的研究成果，本研究對(duì)象是處于4個(gè)不同發(fā)育階段的小鼠，分別為幼齡、性成熟、體成熟和老齡小鼠，通過HE染色法、免疫組織化學(xué)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，研究小鼠心肌的一般形態(tài)和MyoG基因在心肌中的表達(dá)情況，為小鼠心肌生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制和肌肉疾病的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選取不同發(fā)育階段（幼齡、性成熟、體成熟、老齡）的健康小鼠各5只（由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝生物工程實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.1.2 主要試劑和儀器 試劑有4%多聚甲醛固定液（北京索萊寶科技有限公司）、熔點(diǎn)為54～56℃的石蠟、梯度酒精、二甲苯、PBS沖洗液（索萊寶科技有限公司）、免疫組織化學(xué)試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）、MyoG多克隆抗體（武漢三鷹）、蘇木精、伊紅、中性樹脂封膠、Trizol（美國(guó)Invitrogen公司）、熒光定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本 TaKaRa公司）、DNAMarker（美國(guó) Thermo公司）、MSTN基因上下游引物（北京六合華大基因科技有限公司）等。

儀器有光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica公司）、制冰機(jī)（寧波格蘭特儀器廠）、瓊脂糖凝膠電泳槽（北京六一儀器廠生產(chǎn)）、qPCR儀器（美國(guó)Life technologies公司）、普通PCR儀（美國(guó)Bio RAD公司）、紫外凝膠成像儀（日本Panasonic公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取材與固定 采取斷頸法處死小鼠，分別取小鼠心肌，橫切成2塊，其中一塊保存于固定液，用于后面的切片制作、HE染色和免疫組化；另外一塊保存于液氮。

1.2.2 組織包埋及石蠟切片制作 浸蠟前多次反復(fù)熔蠟。將固定好的組織修成0.5 cm大小的方塊。經(jīng)梯度酒精脫水和二甲苯透明后，將組織塊放置于組織包埋機(jī)中充分浸蠟3 h。將組織包埋于包埋盒中，待完全凝固后進(jìn)行切片。

1.2.3 HE染色 分別取幼年、性成熟、體成熟和老年小鼠的心肌組織切片各3張，將切片放置于60℃烤片機(jī)上加熱片刻，以避免組織脫片，然后進(jìn)行脫蠟、蘇木精染色、脫水、伊紅染色、脫水透明、中性樹脂封片、鏡檢。

1.2.4 免疫組織化學(xué) 分別取4個(gè)發(fā)育階段小鼠心肌的切片各3張，首先將心肌組織切片進(jìn)行脫蠟并用PBS緩沖液清洗3次，每次3 min，然后進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶封閉，待封閉結(jié)束后用PBS緩沖液清洗，之后用羊血清再次進(jìn)行封閉，在4℃環(huán)境中過夜孵育一抗。次日，經(jīng)PBS緩沖液適度清洗切片后滴加二抗，室溫孵育10 min，繼續(xù)用PBS緩沖液清洗，清洗3次后滴加顯色劑，然后用蘇木精復(fù)染30 s，最后進(jìn)行脫水透明及封片。

1.2.5 總RNA的提取和cDNA的合成 取出凍存的組織放入研缽中快速研磨，將研磨成粉狀的組織放入加有Trizol的EP管中，充分振蕩混勻，Trizol法提取心肌總RNA，依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，取0.5 μg以上的RNA用于反轉(zhuǎn)錄。

1.2.6 引物的設(shè)計(jì) 試驗(yàn)所用引物均根據(jù)Gen Bank上對(duì)應(yīng)小鼠的序列，利用Premier 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，由北京華大公司合成，引物序列如表1所示。

表1 引物序列信息

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以cDNA為模板，使用熒光定量試劑盒在熒光定量PCR儀上進(jìn)行基因檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系10 μL：SYBR Permix Ex Taq 5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL，上、下游引物各 0.4 μL，cDNA模板 100 ng，DEPC 水補(bǔ)足10 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性 10 min；95℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 20 s。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPad PrismTM軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育階段小鼠心肌的形態(tài)

小鼠心肌切片經(jīng)HE染色后，在顯微鏡下可見其細(xì)胞核呈橢圓形。幼齡小鼠的肌細(xì)胞排列緊密，幾乎不見間隔，細(xì)胞與胞核數(shù)量多（圖1-A）；性成熟小鼠心肌的細(xì)胞間隔較幼齡小鼠增大增寬，細(xì)胞體積增大且數(shù)量減少（圖1-B）；體成熟和老年小鼠較幼齡小鼠肌間隔顯著增大，細(xì)胞數(shù)明顯減少且肥大（圖 1-C，D）。

2.2 不同發(fā)育階段小鼠心肌的MyoG表達(dá)定位研究

從圖2可以看出，MyoG基因在4個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)，表達(dá)部位為細(xì)胞質(zhì)，且表達(dá)量存在差異性。MyoG基因在小鼠幼齡時(shí)期心肌組織的表達(dá)量顯著高于其他3組（圖2-A），性成熟和體成熟小鼠心肌中表達(dá)量明顯減少（圖2-B，2-C），在老齡小鼠心肌中表達(dá)最少（圖2-D）。表明隨著小鼠年齡的增加，MyoG的相對(duì)表達(dá)量會(huì)逐漸降低，表達(dá)位置不會(huì)發(fā)生明顯改變。

2.3 不同發(fā)育階段小鼠心肌中MyoG的mRNA表達(dá)情況

為了進(jìn)一步研究不同發(fā)育階段小鼠心肌中MyoG的表達(dá)差異，本研究提取了小鼠心肌的總RNA，檢測(cè)其mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明，幼年、性成熟和體成熟時(shí)期小鼠心肌中MyoG的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異，但在老年時(shí)期明顯降低（圖3）。

3 討論

MyoG是典型的成肌調(diào)節(jié)因子之一，其表達(dá)水平的高低在肌細(xì)胞的各個(gè)發(fā)育階段都有至關(guān)重要的影響。欒兆進(jìn)等[11]通過研究MyoG對(duì)不同日齡綿羊的背最長(zhǎng)肌和肱二頭肌中IMF沉積的影響發(fā)現(xiàn)，MyoG基因在2塊肌肉上的表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，不同肌肉上MyoG基因的表達(dá)量無明顯差異，但不同日齡的綿羊肌肉中MyoG基因的表達(dá)量明顯不同。趙青[12]通過研究肌細(xì)胞生成素多態(tài)性對(duì)金華豬生長(zhǎng)性狀的影響發(fā)現(xiàn)，母豬在生長(zhǎng)早期發(fā)育較慢，而公豬在早期就具有很快的生長(zhǎng)速度，同時(shí)引用多位學(xué)者的研究結(jié)果證實(shí)了豬和人類與鼠的MyoG基因序列有96%的同源性[13-15]，由此可知，同品種間不同性別MyoG基因的表達(dá)也會(huì)存在差異。此外，鄺良德等[14]對(duì)家畜MyoG基因的結(jié)構(gòu)和功能研究發(fā)現(xiàn)，MyoG基因在豬胎兒期表達(dá)水平較高，在之后的發(fā)育中具有下降的趨勢(shì)[16]。

近年來，各種心臟疾病的發(fā)病率越來越高，關(guān)于心臟的研究也日漸深入，心肌是心臟的重要組成部分，對(duì)于心臟功能的維持至關(guān)重要。心肌切片的HE染色結(jié)果表明，心肌纖維大多呈短柱狀，細(xì)胞核數(shù)量并不固定，單核及多核細(xì)胞都可以觀察到，細(xì)胞核呈卵圓形且多位于細(xì)胞中央，有些則散布在胞質(zhì)邊緣。李碩[17]、劉錚鑄等[18]研究了MyoG基因的啟動(dòng)子序列，結(jié)果顯示，MyoG基因在肌細(xì)胞終末分化過程中不可或缺，同時(shí)也調(diào)控肌細(xì)胞的融合過程；王穎薇等[19]通過研究心肌補(bǔ)片的制備及其結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)，得出肌纖維數(shù)目在生長(zhǎng)發(fā)育過程中不斷變化且最終趨于穩(wěn)定的結(jié)論。賈徑等[9]關(guān)于鴨心組織中MyoG基因表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，MyoG基因在心臟生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，其在心肌整個(gè)發(fā)育過程中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。本試驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，MyoG基因在心肌中表達(dá)，表達(dá)部位在細(xì)胞質(zhì)，且表達(dá)不均勻。此外，qPCR結(jié)果表明，MyoG基因在小鼠心肌中的表達(dá)量隨年齡的增長(zhǎng)而下降。這與已有的研究結(jié)果相似。而MyoG基因呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，其原因可能是由于小鼠生長(zhǎng)發(fā)育過程中該基因發(fā)揮顯著作用，促進(jìn)心肌細(xì)胞分化，而當(dāng)小鼠發(fā)育結(jié)束后，該基因的任務(wù)基本完成，此時(shí)細(xì)胞抑制素開始發(fā)揮作用，MyoG基因開始逐漸減少。該過程符合小鼠生長(zhǎng)發(fā)育的正常規(guī)律。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，幼齡、性成熟、體成熟和老齡這4個(gè)發(fā)育階段的小鼠心肌中均有MyoG基因的表達(dá)，且均存在于細(xì)胞質(zhì)中。其表達(dá)水平與生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，隨年齡增長(zhǎng)逐漸下降，尤其在老年鼠中顯著降低。