張金源 杜紫荊 苗利華 李娜 馮欣

【摘 要】殺線蟲海洋枝頂孢霉BH0531是以松材線蟲為靶標從渤海水域分離獲得的一株海洋真菌。為進一步探明其活性代謝物的性質(zhì)和類型，實驗采用非靶向代謝組學分析，對發(fā)酵液及菌體代謝物進行定性檢測鑒定測定結果顯示，發(fā)酵液與菌體共有的代謝物160種，只存在于發(fā)酵液中的代謝物87種。其中與乙酰膽堿酯酶活性相關物質(zhì)有3種;促進植株生長作用相關物質(zhì)有6種;抗氧化相關物質(zhì)有6種;抑菌相關物質(zhì)有3種。從代謝物角度為BH0531菌株的進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

【關鍵詞】海洋枝頂孢霉;活性代謝物;非靶向代謝組學

中圖分類號： S476.1 文獻標識碼： A文章編號： 2095-2457（2019）04-0239-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.04.093

Comparative analysis on fermentation broth and bacterial actives of nematicidal ?Marine fungi BH0531

ZHANG Jin-yuan1 DU Zi-jing1 MIAO Li-hua1 LI Na1 FENG Xin1，2 MENG Qing-heng1，2* SUN Jian-hua1，2

（1.College of Life Science， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China;

2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance， Tianjin 300387， China）

【Abstract】The nematocidal marine-derived Acremonium sp. BH0531 is a marine fungus isolated from the Bohai Seawater with the target of pinewood nematode. In order to further explore the nature and type of active metabolites， the experiment used non-targeted metabolomics analysis to qualitatively detect and determine metabolites from fermentation broth and fungal cell body . The results showed that 160 metabolites shared by fermentation broth and cell body and 87 metabolites present only in the fermentation broth. Among them， there are 3 kinds of active substances related to the activity of acetylcholinesterase; 6 kinds of active substances related to plant growth; 6 kinds of active substances related to anti-oxidation ; 3 kinds of active substances antibacterial related. It provides experimental basis for the further development and utilization of BH0531 strains from the perspective of metabolites.

【Key words】Marine-derived Acremonium sp.;Active metabolites; Non-targeted metabolomics

殺線蟲海洋枝頂孢霉BH0531是以松材線蟲為靶標從渤海水域分離獲得的一株海洋真菌。該菌經(jīng)形態(tài)和分子生物學鑒定為枝頂孢屬的波氏枝頂孢霉海棲型變種（Acremonium potronii var. marine BH-0531）[1]，其發(fā)酵代謝物具有明確的殺線蟲活性[2]，且對根結線蟲和腐生性的秀麗線蟲殺線效果更強[3]。研究表明，BH0531菌株發(fā)酵代謝物除殺線蟲活性外，還具有明確的廣譜抑菌活性，其中對革蘭氏陽性菌作用最為明顯[4]，對白色念珠菌也具有明確的抑制作用[5]，并具有改善土壤微生態(tài)環(huán)境的作用[6]。生物活性分析顯示，活性代謝物具有明顯的抑制線蟲體內(nèi)抗氧化保護酶系的作用，并對神經(jīng)遞質(zhì)相關的乙酰膽堿酯酶也具有明顯的抑制作用[7]，而對感染線蟲的染病植株的保護酶系活性則具有促進作用[8]。為進一步明晰這些生物活性的物質(zhì)基礎和具體作用成分，以及各成分與功能的關系，實驗對BH0531菌株及其發(fā)酵代謝物進行了進一步的非靶向代謝物組學分析，旨在從代謝物的角度為BH0531菌株的進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

海洋真菌枝頂孢霉（Acremonium sp. BH0531），菌種保藏號CGMCC-5445，由天津師范大學生命科學學院微生物實驗室保藏與提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

保藏及活化培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g/L煮汁，葡萄糖20g/L，瓊脂15g/L，pH自然，蒸餾水定容至1000ml，121℃、0.1Mpa滅菌20min。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：察氏培養(yǎng)基3g/L NaNO3，2g/LK2HPO4，4g/LMgSO4，6g/L KCL，0.15g/L FeSO4，25g蔗糖/L，蒸餾水定容至1L，pH值自然，121℃、0.1Mpa滅菌20min。

1.2 儀器與設備

FY-EH-N真空泵：昆山熙日機械設備有限公司;AB Triple TOF 5600/6600質(zhì)譜儀：AB SCIEX;Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀：Agilent;低溫高速離心機 ：Eppendorf5430R;HILIC 色譜柱：Waters， ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7μm，2.1mm×100mm column;T3色譜柱：Waters， ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm， 2.1mm× 100mm column。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵液的獲得

將保藏的海洋枝頂孢霉菌種接入活化培養(yǎng)基，26℃靜置培養(yǎng)7d。取新鮮培養(yǎng)的菌株斜面，加入無菌水洗下孢子，制成1×106個/mL的孢子懸液，以2%的接種量接入裝有50mL液體基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中。26℃，120r/min 震蕩培養(yǎng)4天，獲得發(fā)酵液粗液。

1.3.2 待測樣品的預處理

菌體收集：將培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)布氏漏斗過濾，將菌體分別收集到1.5mL無菌離心管中，無菌PBS洗滌，5000g 4℃離心5min，棄去上清，收集在離心管中，重復3次。

發(fā)酵濾液制備：將布氏漏斗過濾的初級濾液經(jīng)孔徑為0.22μm的微孔膜過濾后獲得所需發(fā)酵液，保存在15mL無菌離心管中備用。

1.3.3 代謝物組學分析

制備好的待測菌體樣本和發(fā)酵濾液樣本提送上海中科新生命公司（APT）進行非靶向代謝組學分析，測試條件如下：

色譜條件：將樣品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)（UHPLC） HILIC色譜柱進行分離; 柱溫25℃; 流速0.3mL/min; 進樣量2μL; 整個分析過程中樣品置于4℃自動進樣器中。

Q-TOF質(zhì)譜條件：將樣品分別采用電噴霧電離（ESI）正離子和負離子模式進行檢測分析。樣品經(jīng)UHPLC分離后用Triple TOF 5600/6600質(zhì)譜儀（AB SCIEX）進行質(zhì)譜檢測分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵液與菌體共有代謝物種類

發(fā)酵液與菌體共有代謝物160種，對比結果見表1。

2.2 發(fā)酵液特有的代謝物種類

將發(fā)酵液代謝物質(zhì)和菌體代謝物質(zhì)進行比較分析，得到只存在于發(fā)酵液中代謝物共87種，結果在表2給出。

2.3 發(fā)酵液中與殺線蟲活性相關的主要物質(zhì)種類分析

將發(fā)酵液中特有的代謝物按照功能類型進行歸類，歸類結果在表3給出。

3 討論與結論

文獻表明青霉酸、橙皮素、甘油磷酸膽堿與乙酰膽堿酯酶活性相關[17]，水楊酸、泛酸、氨基葡萄糖、海藻糖、甜菜堿、3-脫氫莽草酸對植物的保護酶系活性具有促進作用[9-11，13-14，16];3-脫氫莽草酸、泛酸、氨基葡萄糖、葫蘆巴堿、橙皮素、甜菜堿對組織抗氧化保護酶系起到抑制作用[11-12，14 ];氨基葡萄糖，青霉酸，橙皮素具有明確的抑菌作用[14，17]。

分析結果顯示（見表3），BH0531菌株發(fā)酵液中檢出上述活性代謝物，分別具有神經(jīng)毒性、促植株生長、抑制抗氧化保護酶系、抑菌等作用，從代謝物角度為BH0531菌株的殺線蟲生物活性提供了實驗支撐，并為進一步的靶向分析及海洋真菌殺線劑的開發(fā)研究奠定了實驗基礎。

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