鄒盛楠，李春鳴，楊 華，梁 娜

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 組胚學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，位居消化道惡性腫瘤的首位[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年有990 000例新診斷的胃癌病例[2]。目前，臨床上以手術(shù)治療為主，輔以放化療。隨著治療方法的不斷改進(jìn)，胃癌患者的生存率得到顯著提高。然而，由于胃癌的早期癥狀不典型，容易被忽視，患者就診時(shí)多伴有明顯浸潤和廣泛轉(zhuǎn)移，手術(shù)后中位存活時(shí)間常為12～20個(gè)月[2]。胃癌患者生活質(zhì)量的大大降低，給患者及其家庭，乃至社會造成了沉重的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，探索潛在的腫瘤抑制基因，明確其新的治療靶點(diǎn)，對于胃癌的臨床治療是極其必要的。

KAI1又稱為CD82，研究發(fā)現(xiàn)它不僅與細(xì)胞分化、生長和增殖等生理過程有關(guān)，還與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移等病理狀態(tài)有關(guān)。近年研究表明，KAI1基因是前列腺癌、肺癌、肝癌、甲狀腺癌和胰腺癌等諸多惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移抑制基因[3]，但不同胃癌細(xì)胞中KAI1基因的表達(dá)是否有差異，其對體內(nèi)外生長、遷移是否有影響，尚未有相關(guān)研究報(bào)道。本研究擬采用Western Blot、RT-PCR等方法對不同分化程度胃腺癌細(xì)胞中KAI1蛋白及mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)合MTT、細(xì)胞周期和Transwell實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步通過構(gòu)建裸鼠腹腔移植瘤模型，比較與分析不同分化程度胃腺癌細(xì)胞在體內(nèi)、外生長及遷移情況，旨在為KAI1基因高低表達(dá)胃癌細(xì)胞株的篩選以及KAI1基因分子機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 人胃腺癌低分化BGC823細(xì)胞株由遵義醫(yī)科大學(xué)病理教研室保存，人胃腺癌中分化SGC7901細(xì)胞株、人胃腺癌高分化MKN28細(xì)胞株購自廣州吉妮歐生物有限公司；南美胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自于GIBCO公司；兔抗人KAI1單克隆抗體購自美國Abcam公司；鼠抗人Tubulin單克隆抗體、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴(kuò)增試劑盒購自北京全式金生物；KAI1、Actin正反向引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成； MTT試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒購自北京索萊寶公司；Transwell小室(24孔板)購自美國康寧；4 周齡健康雌性 BALB/c-nu 裸鼠購自重慶滕鑫公司SCXK(京)2014-0004。

1.1.2 儀器 酶標(biāo)儀(1500) 美國Thermo，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(IC1000)中國睿玨儀器，流式細(xì)胞器(CytoFLEX)德國Beckman，實(shí)時(shí)定量 PCR 儀(MyiQ2)、蛋白曝光系統(tǒng) (ChemiDoc)美國 BIO-RAD。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 選取含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基對人胃腺癌BGC823細(xì)胞、SGC7901細(xì)胞和MKN28細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。分別置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育，每隔1～2天進(jìn)行換液，待細(xì)胞長至80%以上時(shí)胰酶消化細(xì)胞傳代。

1.2.2 Western blot檢測KAI1蛋白表達(dá) 在對數(shù)生長期的3種胃腺癌細(xì)胞中分別加入RIPA裂解液及PMSF提取總蛋白(100∶1)，BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min使蛋白變性，用SDS-PAGE電泳進(jìn)行條帶分離，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉1.5 h，一抗4 ℃冰箱孵育過夜(兔抗人KAI1單克隆抗體稀釋倍數(shù)1∶1 000，鼠抗人Tubulin單克隆抗體稀釋倍數(shù)1∶5 000)，次日TBST清洗PVDF膜3次，每次15分鐘，二抗常溫孵育1 h(羊抗兔、羊抗鼠二抗稀釋倍數(shù)均1∶10 000)，洗膜，ECL曝光顯影，Image J軟件進(jìn)行灰度值計(jì)算。

1.2.3 RT-PCR檢測KAI1 mRNA表達(dá) 采用Trizol法提取對數(shù)生長期的3種胃腺癌細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度及純度(純度要求在1.8～2.0之間)，根據(jù)制造商說明，通過使用逆轉(zhuǎn)錄酶，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(轉(zhuǎn)錄參數(shù)：25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ forever)，KAI1的正義和反義的引物分別是5’-TGTCCTGCAAACCTCCTCCA-3’和5'-CCATGAGCATAGTGACTGCCC-3'。以Actin為對照，它的正義和反義的引物分別是5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3'和5'-GGGCCGGACTCGTCATAC -3'。熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增(擴(kuò)增體系10μL)，PCR循環(huán)參數(shù)(95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán))，利用2-△△Ct法進(jìn)行相對定量分析。

1.2.4 MTT檢測細(xì)胞生長曲線 用胰酶將對數(shù)生長期的3種胃腺癌細(xì)胞消化為單個(gè)細(xì)胞懸液，在96孔板中每孔加入5×103個(gè)細(xì)胞，體積100 μL，每組設(shè)置至少3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后的0、24、48、72 h，每孔分別加入MTT溶液20 μL，孵箱孵育4 h，倒掉上清液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，測定490 nm波長處各孔吸光度，并繪制生長曲線圖。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 用胰酶將對數(shù)生長期的3種胃腺癌細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，1 000 rpm離心5 min，用預(yù)冷的PBS洗3次，離心棄上清，加入-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇，吹打均勻，封口膜封閉后4 ℃保存過夜。檢測前離心、洗滌，用RNase和PI處理細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測各周期DNA含量。

1.2.6 Transwell檢測細(xì)胞遷移 用胰酶將對數(shù)生長期的3種胃腺癌細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，每個(gè)transwell小室中接種5×104個(gè)細(xì)胞(200 μL)，下層加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基550 μL，放入37 ℃、5%CO2孵箱中孵育，24 h后取出小室；用PBS清洗小室兩遍，多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色，清洗，晾干，切膜放入載玻片，中性樹膠封片，顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)視野IPWIN32計(jì)數(shù)。

1.2.7 構(gòu)建裸鼠腹腔移植瘤 選取4周齡雌性裸鼠15只，隨機(jī)分為3組，實(shí)驗(yàn)前在SPF條件下飼養(yǎng)3d適應(yīng)環(huán)境(SPF環(huán)境溫度控制在20 ℃，濕度在50%左右)，操作前對所需器械進(jìn)行紫外照射消毒。胰酶消化對數(shù)生長期的3種胃腺癌細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取0.2 mL濃度為 1×107/mL接種于裸鼠腹腔，操作迅速，動作輕柔，棉球按壓防止漏液。接種后觀察并記錄裸鼠的精神、飲食情況，尤其注意觀察腹部有無變大、膨出。在SPF條件下飼養(yǎng)4周后頸部脫臼處死各組裸鼠，解剖裸鼠并觀察體內(nèi)移植瘤生長、轉(zhuǎn)移情況(腸系膜、腹膜、大網(wǎng)膜、肝、腎、胃、脾、胰腺、肺等出現(xiàn)移植瘤的每個(gè)臟器計(jì)數(shù)為1)，并切取相應(yīng)的組織行病理組織學(xué)檢查判斷重要臟器轉(zhuǎn)移情況。

2 結(jié)果

2.1 3組胃腺癌細(xì)胞KAI1蛋白的表達(dá) 人胃腺癌BGC823細(xì)胞、SGC7901細(xì)胞和MKN28細(xì)胞的KAI1蛋白相對表達(dá)量呈依次遞增趨勢，且3組細(xì)胞間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。

*：3組細(xì)胞中KAI1蛋白的相對表達(dá)量兩兩比較，P<0.05。 圖1 KAI1蛋白在BGC823、SGC7901、MKN28的相對表達(dá)量

2.2 3組胃腺癌細(xì)胞KAI1 mRNA的表達(dá) BGC823細(xì)胞、SGC7901細(xì)胞和MKN28細(xì)胞的KAI1mRNA相對表達(dá)量也是呈依次遞增趨勢，且3組細(xì)胞間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與蛋白的表達(dá)水平相一致(見圖2)。

*：3組細(xì)胞中KAI1mRNA的相對表達(dá)量兩兩比較，P<0.05。 圖2 KAI1 mRNA在BGC823、SGC7901、MKN28的相對表達(dá)量

2.3 3組胃腺癌細(xì)胞生長曲線 檢測3組細(xì)胞0、24、48、72 h光密度值，將0 h OD值設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算出3組細(xì)胞24、48、72 h的相對增殖率(見圖3)。24 h BGC823、SGC7901和MKN28細(xì)胞相對增殖率呈依次遞減趨勢，且3組細(xì)胞之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；48 h MKN28細(xì)胞相對增殖率，低于人胃腺癌BGC823、SGC7901細(xì)胞，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；72 h 3組細(xì)胞兩兩比較，相對增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；BGC823細(xì)胞72 h相對增殖率明顯高于24 h和48 h(P<0.05)；SGC7901細(xì)胞在24、48、72 h間細(xì)胞相對增殖率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MKN28細(xì)胞在72 h相對增殖率高于24 h和48 h的細(xì)胞相對增殖率(P<0.05)。

2.4 3組胃腺癌細(xì)胞周期差異 BGC823、SGC7901和MKN28細(xì)胞S期的比例呈逐漸下降的趨勢，其中BGC823細(xì)胞S期比例最高，DNA合成最多，增殖能力最強(qiáng)，且3組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖4，表1)。

★：24 h 3組細(xì)胞間相對增殖率比較，▲：48 h MKN28細(xì)胞與BGC823細(xì)胞及SGC7901細(xì)胞相對增殖率比較；#：BGC823細(xì)胞在72 h與24 h及48 h細(xì)胞相對增殖率比較；*：SGC7901細(xì)胞在24、48、72 h細(xì)胞相對增殖率比較；◆：MKN28細(xì)胞在72 h與24 h及48 h時(shí)細(xì)胞相對增殖率比較，P<0.05。 圖3 BGC823、SGC7901、MKN28細(xì)胞的生長曲線

圖4 BGC823、SGC7901、MKN28細(xì)胞周期對比

細(xì)胞S期(%)BGC82323.25±0.70?SGC790118.70±1.00?MKN2814.47±1.55?

* ：3組細(xì)胞S期兩兩比較，P<0.05。

2.5 3組胃腺癌細(xì)胞遷移對比 BGC823、SGC7901和MKN28細(xì)胞的遷移數(shù)目呈逐漸減少的趨勢，且3組細(xì)胞間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖5)。

* ：3組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)兩兩比較，P<0.05。圖5 BGC823、SGC7901、MKN28遷移細(xì)胞數(shù)對比

2.6 3組裸鼠腹腔移植瘤對比 在構(gòu)建腹腔移植瘤模型過程中，無裸鼠死亡，且注射部位無皮膚潰爛、流膿。4周后將裸鼠脫頸處死，BGC823組、SGC7901組和MKN28裸鼠腸系膜移植瘤數(shù)目、重量依次減少(見圖6～8，表2)，3組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀察3組裸鼠腹腔移植瘤轉(zhuǎn)移部位，BGC823組腹腔移植瘤轉(zhuǎn)移臟器數(shù)最多，主要是在腸系膜、大網(wǎng)膜、腹膜、胃、肝、胰腺、脾臟、腎臟及橫隔，而MKN28組主要是腸系膜和大網(wǎng)膜，3組裸鼠腹腔移植瘤轉(zhuǎn)移臟器數(shù)對比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

A:BGC823組；B：SGC7901組；C：MKN28組。圖6 3組裸鼠腸系膜移植瘤表現(xiàn)

圖7 3組裸鼠腸系膜移植瘤對比

A:BGC823組；B：SGC7901組；C：MKN28組；HE×200。圖8 3組裸鼠移植瘤組織病理染色

組別成瘤率(%)移植瘤數(shù)(腸系膜)瘤重(腸系膜,g)轉(zhuǎn)移器官BGC82310078.20±7.25★1.37±0.23◆8.40±0.89▲SGC790110038.40±5.94★0.25±0.06◆ 6.20±1.30▲MKN2810011.20±3.03★0.01±0.01◆ 1.40±0.55▲

★：3組裸鼠腹腔腸系膜移植瘤數(shù)目兩兩比較，P<0.05；◆：3組裸鼠腹腔腸系膜瘤體重量兩兩比較，P<0.05；▲：3組裸鼠腹腔移植瘤轉(zhuǎn)移器官數(shù)兩兩比較，P<0.05。

3 討論

胃癌是常見的四大惡性腫瘤之一，也是腫瘤中導(dǎo)致死亡的第二大原因[4]，嚴(yán)重影響人類的健康水平。中國是胃癌發(fā)病率較高的國家，但目前進(jìn)展期胃癌患者5年生存率不足30%[5]，因此尋求新的治療靶點(diǎn)對于提高胃癌患者的生存率極為重要。腫瘤抑制因子可通過影響腫瘤細(xì)胞粘附、增殖、遷移等能力，從而控制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此，當(dāng)腫瘤抑制因子丟失時(shí)，惡性腫瘤的進(jìn)展則顯著加快。

KAI1基因是一個(gè)80KB大小的DNA，由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成[6]。KAI1基因的結(jié)構(gòu)與CD82相同，其編碼的蛋白質(zhì)由267個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為29 600，是具有廣譜生物學(xué)功能的4次跨膜超家族成員之一[7]。1995年，Dong等[8]將KAI1基因引入大鼠AT6.1前列腺癌細(xì)胞中后，發(fā)現(xiàn)前列腺癌的肺轉(zhuǎn)移率大大減少，KAI1基因的表達(dá)與惡性腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，KAI1基因在具有低轉(zhuǎn)移潛力的鼻咽癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，而在具有高轉(zhuǎn)移潛力的鼻咽癌細(xì)胞中呈低表達(dá)。Zhang等[10]研究表明KAI1在肝細(xì)胞癌中表達(dá)水平較低，且患者血清中KAI1的表達(dá)與TNM分期、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)或腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)。喉癌中KAI1表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也呈負(fù)相關(guān)[11]。此外，在胃癌組織中，KAI1基因與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵入深度、TNM分期及存活時(shí)間也是相互關(guān)聯(lián)的[12]。但關(guān)于不同胃癌細(xì)胞中KAI1基因表達(dá)是否有差異以及KAI1基因?qū)Σ煌赴┘?xì)胞的生長、遷移是否有影響卻尚未研究。

為初步探討KAI1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞株的影響，本課題根據(jù)分化程度選取了3種胃腺癌細(xì)胞株，應(yīng)用Western Blot及RT-PCR對KAI1基因的蛋白及mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人胃腺癌BGC823、SGC7901和MKN28細(xì)胞中KAI1基因的表達(dá)呈依次遞增趨勢，且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這表明分化程度越低的胃腺癌細(xì)胞，KAI1基因的相對表達(dá)量越低，從而提示KAI1基因的表達(dá)水平可能與胃腺癌分化程度有關(guān)，這與康麗霞等[13]研究KAI1基因與胃癌分化關(guān)系時(shí)所得結(jié)果一致。

本研究體外通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)人胃腺癌BGC823、SGC7901、MKN28細(xì)胞相對增殖率呈依次遞減趨勢(P<0.05)，同時(shí)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)人胃腺癌BGC823、SGC7901、MKN28細(xì)胞S期所占的比例也呈依次遞減(P<0.05)，其中S期占比越高的細(xì)胞株，DNA合成越多，增殖能力越強(qiáng)，說明分化程度越低的胃腺癌細(xì)胞，增殖能力越強(qiáng)，這與KAI1基因的相對表達(dá)量恰恰相反。從而提示KAI1基因的表達(dá)水平可能與細(xì)胞增殖有關(guān)。Chai等[14]通過研究KAI1過表達(dá)后的口腔癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其體外增殖能力明顯減弱，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。通過Transwell實(shí)驗(yàn)得出人胃腺癌BGC823、SGC7901和MKN28細(xì)胞的遷移數(shù)目依次呈下降的趨勢(P<0.05)，與胃腺癌細(xì)胞相對增殖率、S期占比結(jié)果一致，與KAI1的相對表達(dá)量結(jié)果相反。說明KAI1基因表達(dá)水平越高的胃腺癌細(xì)胞株，體外遷移能力越弱，與Si等[15]在肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致，這提示KAI1基因?qū)?xì)胞的體外遷移可能有負(fù)向調(diào)控作用。

本研究通過進(jìn)一步構(gòu)建裸鼠腹腔移植瘤模型，成功模擬體內(nèi)胃腺癌細(xì)胞的種植轉(zhuǎn)移情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BGC823組、SGC7901組、MKN28組裸鼠移植瘤數(shù)量、重量以及轉(zhuǎn)移臟器數(shù)目均呈依次遞減趨勢(P<0.05)。這說明KAI1表達(dá)越低的胃腺癌細(xì)胞，移植瘤的重量、數(shù)量及轉(zhuǎn)移臟器數(shù)越多，從而提示KAI1基因的表達(dá)對胃腺癌細(xì)胞移植瘤生長及轉(zhuǎn)移有影響。Xu等[16]研究發(fā)現(xiàn)KAI1基因過表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞株，其裸鼠移植瘤大小、轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)及轉(zhuǎn)移臟器數(shù)較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞株低，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，并且在乳腺癌中KAI1基因也是乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的負(fù)調(diào)控因子[17]。因此推測，KAI1基因不僅對體外生長、遷移具有調(diào)控作用，對體內(nèi)也有相應(yīng)調(diào)控作用，預(yù)示KAI1基因可以作為判斷胃癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)測預(yù)后的有效指標(biāo)?；贙AI1基因調(diào)控胃癌細(xì)胞生長、遷移的能力，這可能通過與MiR-99b、MMP-2、MMP-9、TAp73等[18-20]相互作用來調(diào)控，具體有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，我們推測KAI1基因的表達(dá)可能與胃腺癌細(xì)胞的生長、遷移能力有關(guān)，KAI1基因高表達(dá)的細(xì)胞株，其生長、遷移能力弱，反之則生長、遷移能力強(qiáng)，這將為后續(xù)實(shí)驗(yàn)篩選KAI1高低表達(dá)的胃癌細(xì)胞株以及開展胃癌轉(zhuǎn)移分子機(jī)制研究提供理論依據(jù)。