鄭小翠，王 森，歐水平，陳 靈，蔡迎迎，任 麗

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義 563099)

急性胰腺炎(acute pancreatities,AP)是臨床上常見(jiàn)的急腹癥，具有較高的發(fā)病率和病死率，20% ～30%發(fā)展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatities,SAP)[1]。SAP病情兇險(xiǎn)，常伴有全身炎癥反應(yīng)綜合征及全身多器官功能不全。清胰Ⅱ號(hào)湯由大黃、赤芍、梔子、延胡索、丹皮、木香、厚樸及芒硝等 8 味藥組成，具有疏肝利膽、清熱瀉火、止痛通便的功效，臨床常用于治療AP和SAP，療效顯著[2-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，清胰復(fù)方的作用機(jī)制是多方面的，能抑制胰酶釋放及其活性，增加腸蠕動(dòng)；短期內(nèi)促進(jìn)腸排空，減輕胃腸壓力及腹壓；改善胃腸道功能和毛細(xì)血管通透性；還可以阻斷炎癥因子釋放，減少炎癥因子對(duì)患者胰腺等器官的損害；防止細(xì)菌移位；清除氧自由基，防止過(guò)氧化損傷等[4-6]。

目前，對(duì)于清胰Ⅱ號(hào)湯劑的質(zhì)量控制研究多體現(xiàn)在單一有效成分或幾個(gè)主要有效成分如梔子苷、芍藥苷、丹皮酚、大黃素等的HPLC含量測(cè)定[7-8]，而對(duì)1種或幾種指標(biāo)成分的控制對(duì)于中藥本身多組分、多靶點(diǎn)作用特點(diǎn)而言，不能全面反映中藥復(fù)方制劑有效成分總體特征及其內(nèi)在的質(zhì)量特征，從而不能對(duì)其整體質(zhì)量進(jìn)行控制。采用指紋圖譜方法可以彌補(bǔ)這些缺點(diǎn)，現(xiàn)在指紋圖譜技術(shù)和研究方法已經(jīng)相對(duì)成熟完善，利用指紋圖譜技術(shù)來(lái)控制中藥的質(zhì)量已經(jīng)得到了國(guó)際的認(rèn)可[9-11]。因此，為了更有效地、系統(tǒng)地控制清胰Ⅱ號(hào)湯劑的質(zhì)量，本研究采用HPLC建立清胰Ⅱ號(hào)湯劑的指紋圖譜，對(duì)其中的特征性成分進(jìn)行指認(rèn)，并將清胰Ⅱ號(hào)湯劑的指紋圖譜與組方單味藥材的指紋譜圖進(jìn)行比對(duì)，以獲得專屬、整體的綜合特征信息。

1 材料與方法

1.1 儀器 1260型液相色譜儀，包括DAD檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)；BT125D電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；JA1002電子天平(上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司)；Exceed-Cd-20 型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(成都艾科水處理設(shè)備有限公司)；DL-820D超聲儀(上海之信儀器有限公司)；TD5A-WS離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。2012版 “中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件。

1.2 試藥 大黃素、大黃酸、丹皮酚(購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110756-201512、110757-201607、110708-201407 )，蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、梔子苷、芍藥苷、延胡索乙素、厚樸酚、和厚樸酚、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯(購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)分別為MUST-17030605、MUST-17030603、MUST-17030622、MUST-17020401、MUST-16041901、MUST-17022720、MUST-17031102、MUST-17020205、MUST-16050705、MUST-16041601)，9批清胰Ⅱ號(hào)湯劑(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科代煎，依次標(biāo)記S1～S9)。

大黃(產(chǎn)地四川，批號(hào)160301-170401)、赤芍(產(chǎn)地四川，批號(hào)160601-170401)、炒梔子(產(chǎn)地四川，批號(hào)160301-170401)、丹皮(產(chǎn)地四川，批號(hào)160601-170601)、姜厚樸(產(chǎn)地四川，批號(hào)(160701-170601)、醋延胡索(產(chǎn)地浙江，批號(hào)160801-170701)、木香(產(chǎn)地云南，批號(hào)160301-161101)、芒硝(產(chǎn)地青海，批號(hào)20160302-20161109)均購(gòu)自重慶慧遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司，經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)楊建文主任藥師鑒定以上中藥飲片均合格。甲醇、乙腈為色譜純，水為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 Ultimate LP-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫程序：0～10 min，2%～10% A；10～100 min，10%～30% A；100～130 min，30%～55% A；130～150 min，55%～85% A；柱溫：30℃；流速：1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品4.94、4.90、4.83、4.71、5.29 mg，加少量氯仿使之溶解，加甲醇定容至5 mL，精密稱取梔子苷、芍藥苷、丹皮酚、和厚樸酚、厚樸酚、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、延胡索乙素對(duì)照品5.03、4.95、5.06 、5.11、5.14、5.15、5.16、5.21 mg，加甲醇溶解分別定容至5 mL，得單個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液。

分別精密量取上述單個(gè)對(duì)照品溶液150、150、35、120、100、40、50、230、230、470、90、90、90 μL，加甲醇稀釋至5 mL，得梔子苷、芍藥苷、丹皮酚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、和厚樸酚、厚樸酚、木香烴內(nèi)酯、去氫木香烴內(nèi)酯、延胡索乙素的含量分別為94.63、45.56、46.57、6.92、23.53、19.30、7.54、10.58、30.93、30.99、18.41、18.52、18.74 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備 取9劑清胰Ⅱ號(hào)處方，加適量水煎煮3次，合并煎液，濃縮成2 000 mL，得9批清胰Ⅱ號(hào)湯劑[12]。精密量取清胰Ⅱ號(hào)湯劑5 mL于50 mL離心管中，加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減少的重量，3 500 rpm 離心10 min，取全部上清于蒸發(fā)皿中揮干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? mL ，搖勻，0.22 μm濾膜濾過(guò)，即得。

1.3.4 單味藥材供試品溶液的制備 按清胰Ⅱ號(hào)湯劑制備方法分別制得大黃、赤芍、木香、丹皮、厚樸、梔子、延胡索單味藥材提取液。按1.3.3項(xiàng)下方法制備單味藥材供試品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

1.3.5 樣品的測(cè)定 取混合對(duì)照品溶液、單味藥材供試品溶液及9批清胰Ⅱ號(hào)湯劑供試品溶液，按1.3.1項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。

2 結(jié)果

2.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣 6 次，測(cè)得 HPLC 圖，以梔子苷成分的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果表明各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.10%～0.37%，相對(duì)峰面積 RSD為0.51%～9.33%，表明儀器精密度良好。

2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 制備同一批號(hào)供試品溶液 6份，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.03%～1.63%，相對(duì)峰面積 RSD為0.71%～7.95%，表明供試品處理方法重現(xiàn)性良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一供試品溶液，分別在 0、3、6、 9、 12、 24、36 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.02%～0.84%，相對(duì)峰面積 RSD為0.86%～8.34%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 參照峰的選擇 在HPLC圖譜中26.173 min的色譜峰的峰面積最大且穩(wěn)定，經(jīng)與對(duì)照品對(duì)照鑒定為梔子苷，故選擇其為參照峰 (見(jiàn)圖1和圖2)。

圖1 混合對(duì)照品色譜圖

圖2 9批清胰Ⅱ號(hào)湯HPLC 特征譜圖(S1～ S9)和對(duì)照指紋圖譜(R)

2.4.2 相似度分析 將9批清胰Ⅱ號(hào)湯的HPLC圖譜導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”軟件，以S1為參照?qǐng)D譜，多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜(R)，結(jié)果見(jiàn)圖2。計(jì)算指紋圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，結(jié)果見(jiàn)表1，可見(jiàn)9批樣品相似度均在0.9以上，表明各批樣品與對(duì)照指紋圖譜有良好的相似性。對(duì)共有峰進(jìn)行編號(hào)，以11號(hào)色譜峰(梔子苷)為參照峰，其保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算其他各共有峰的平均相對(duì)保留時(shí)間和平均相對(duì)峰面積，其結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 9批清胰Ⅱ號(hào)湯相似度結(jié)果

批號(hào)S1S2S3S4S5S6S7S8S9RS11.0000.9930.9471.0001.0000.9960.9990.9980.9240.998S20.9931.0000.9570.9950.9930.9900.9940.9910.9360.997S30.9470.9571.0000.9480.9460.9210.9460.9300.9970.963S41.0000.9950.9481.0001.0000.9960.9990.9980.9260.999S51.0000.9930.9461.0001.0000.9960.9990.9980.9230.998S60.9960.9900.9210.9960.9961.0000.9970.9990.8920.991S70.9990.9940.9460.9990.9990.9971.0000.9990.9220.998S80.9980.9910.9300.9980.9980.9990.9991.0000.9030.994S90.9240.9360.9970.9260.9230.8920.9220.9031.0000.943R0.9980.9970.9630.9990.9980.9910.9980.9940.9431.000

表2共有峰平均相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積

峰號(hào)平均相對(duì)保留時(shí)間RSD(%)平均相對(duì)峰面積RSD(%)峰號(hào)平均相對(duì)保留時(shí)間RSD(%)平均相對(duì)峰面積RSD(%)10.362 0.780.13012.97222.174 0.260.01618.4120.477 0.260.0119.24232.230 0.490.02410.0830.533 0.210.03317.59242.318 0.820.01721.7040.565 0.200.03517.99252.451 0.260.02728.4550.586 0.180.0097.12262.665 0.440.00916.1860.598 0.220.0108.94272.867 0.260.00614.8370.609 0.440.01113.53283.197 0.260.03918.4880.681 0.230.0235.76293.233 0.250.01012.8990.791 0.330.04713.00303.316 0.270.04915.28100.808 0.240.05616.63313.560 0.280.04656.98111.001 0.231.0000.00323.667 0.270.0543.71121.140 0.260.2389.46333.774 0.270.00619.81131.281 0.290.8169.57343.877 0.270.01426.84141.485 0.300.01126.89354.249 0.280.00417.13151.675 0.320.01613.63364.389 0.390.01427.32161.711 0.300.04610.93374.609 0.260.03117.33171.799 0.381.49028.10385.070 0.270.00314.43181.915 0.290.04310.63395.146 0.280.01626.48191.947 0.240.0379.70405.245 0.280.00330.90202.042 0.250.0159.19415.310 0.280.03730.20212.117 0.390.03225.48425.3960.280.00623.94

2.4.3 共有峰歸屬分析 取單味藥湯劑和清胰Ⅱ號(hào)湯劑供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，得色譜圖(見(jiàn)圖3)。通過(guò)保留時(shí)間和紫外吸收光譜圖比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，清胰Ⅱ號(hào)湯的共有峰中2、3、4、5、6、7、10、11、15 、19、20、25、26、27、35 號(hào)峰來(lái)源于梔子，12 號(hào)來(lái)源于赤芍，共有峰 16、18 、24、28、29、30、33、34、37、38、42 號(hào)來(lái)源于大黃，23號(hào)來(lái)源于延胡索，31 號(hào)來(lái)源于丹皮，36、39、41 號(hào)來(lái)源于厚樸，40 號(hào)來(lái)源于木香，1號(hào)來(lái)源于梔子和赤芍，8、22號(hào)來(lái)源于梔子和大黃，9號(hào)來(lái)源于丹皮、木香和厚樸，14號(hào)來(lái)源于丹皮、大黃和厚樸，13、17、21、32號(hào)來(lái)源于赤芍和丹皮。經(jīng)鑒定 11、13、23、31、36、37、38、39、40、41、42號(hào)峰分別為梔子苷、芍藥苷、延胡索乙素、丹皮酚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、和厚樸酚、去氫木香烴內(nèi)酯、厚樸 酚、大黃酚，芒硝對(duì)共有峰沒(méi)有貢獻(xiàn)。

圖3 清胰Ⅱ號(hào)湯和各單味藥材的HPLC圖譜

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用 DAD檢測(cè)器在220～400 nm范圍進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，考察了220、230、254、280、300、400 nm 等波長(zhǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，波長(zhǎng)大于280 nm后梔子苷無(wú)紫外吸收，經(jīng)比較后237 nm下色譜峰最為豐富，各色譜峰之間分離度良好，強(qiáng)度較大且均勻，基線平穩(wěn)，因此選擇 237 nm 為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。在研究中發(fā)現(xiàn)，供式品溶液中的成分在 150 min 之前出峰完全，150 min 之后無(wú)色譜峰的出現(xiàn)，因此檢測(cè)時(shí)間定為150 min。

對(duì)9批清胰Ⅱ號(hào)湯劑 HPLC 圖譜進(jìn)行匹配，標(biāo)定了42個(gè)共有峰，并通過(guò)與對(duì)照品、單味藥湯的保留時(shí)間和紫外光譜圖比對(duì)，對(duì)所有共有峰進(jìn)行了組方藥味歸屬分析，指認(rèn)了其中11個(gè)成分。9批樣品在對(duì)照品木香烴內(nèi)酯的出峰位置(43號(hào)峰)均未出峰，單味藥材在相同位置有出峰。劉俊紅等[13]分別考察了60、80、100 ℃加熱不同時(shí)間對(duì)木香水提液中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的影響，結(jié)果表明3個(gè)溫度下兩者含量均降低，隨著溫度的升高，時(shí)間的延長(zhǎng)，木香烴內(nèi)酯含量顯著降低，而去氫木香內(nèi)酯略有降低；在同一時(shí)間內(nèi)， 溫度變化影響顯著，尤其在 100 ℃，加熱 1 h后木香烴內(nèi)酯的含量幾乎損失殆盡 。清胰Ⅱ號(hào)湯劑為醫(yī)院制備，單次煎煮需近300 L水，煎煮時(shí)間雖相同，相比實(shí)驗(yàn)室制備單味藥材，單次提取僅100 mL水，水達(dá)到沸騰狀態(tài)所需時(shí)間更長(zhǎng)，且使用100℃加熱濃縮，長(zhǎng)時(shí)間高溫加熱使樣品湯劑中木香烴內(nèi)酯損失殆盡，而去氫木香內(nèi)酯受溫度影響較小，所以還能檢出。有4批樣品在大黃素甲醚的出峰位置(44號(hào)峰)未出峰，究其原因，可能是由于不同批次大黃的質(zhì)量差異造成的；大黃藥材中大黃素甲醚的含量本身較其他4種蒽醌類成分低，而大黃-赤芍、大黃-梔子、大黃-木香同煎煮會(huì)降低游離型與結(jié)合型大黃素甲醚的量[14]，導(dǎo)致有的批次大黃素甲醚含量低于檢測(cè)限；蒽醌類成分不穩(wěn)定，在煎煮濃縮過(guò)程中受溫度影響易分解；因此未納入共有峰中。

相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，9批樣品的指紋圖譜相似度較高，相對(duì)保留時(shí)間 RSD 均在 1% 以內(nèi)，相對(duì)峰面積RSD為3.71%～30.90% ，丹皮酚的相對(duì)峰面積RSD 56.98%，這可能由于不同批次藥材來(lái)源和質(zhì)量不同，煎煮濃縮過(guò)程使用的是敞口鍋，溫度不易控制，而丹皮酚屬揮發(fā)油，易揮發(fā)，增加丹皮酚損失差異，造成9批樣品中丹皮酚相對(duì)峰面積差異較大。提示需進(jìn)一步控制藥材的質(zhì)量及確保煎煮濃縮時(shí)間、溫度等條件相同。

本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC方法準(zhǔn)確、可靠，對(duì)清胰Ⅱ號(hào)湯劑中的化學(xué)成分進(jìn)行相關(guān)性研究，并對(duì)部分色譜峰予以歸屬?？蛇x擇梔子苷、芍藥苷、延胡索乙素、丹皮酚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、和厚樸酚、去氫木香烴內(nèi)酯、厚樸酚、大黃酚對(duì)照品標(biāo)定的11個(gè)共有峰作為清胰Ⅱ號(hào)湯劑指紋圖譜的質(zhì)控指標(biāo)。存在不能定量且分析時(shí)間長(zhǎng)的不足，已報(bào)道文獻(xiàn)[7-8]只測(cè)定了復(fù)方中單個(gè)或幾個(gè)成分，本實(shí)驗(yàn)選擇11個(gè)質(zhì)控指標(biāo)更全面，且指紋圖譜全峰能全面反應(yīng)全方成分；可為其質(zhì)量控制提供一定參考。