陳秀霞 池洪樹(shù) 許斌福 陳晨汐 方冬蘭 龔 暉

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 福州 350003)

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）是海水魚(yú)的主要致病菌，可導(dǎo)致鲆鰈魚(yú)、軍曹魚(yú)、石斑魚(yú)以及養(yǎng)殖在含鹽水體中的鰻鱺、羅非魚(yú)等魚(yú)類發(fā)病[1-5]，研究該菌與宿主的互作關(guān)系，是研發(fā)創(chuàng)傷弧菌病防控技術(shù)的關(guān)鍵。由于養(yǎng)殖的宿主魚(yú)個(gè)體差異大，基因背景未完全明晰，且常有創(chuàng)傷弧菌感染的背景，用養(yǎng)殖的宿主魚(yú)為對(duì)象開(kāi)展研究，得到的結(jié)果未必可靠，因此，有必要通過(guò)基因背景明晰的模式魚(yú)開(kāi)展相關(guān)研究。

孔雀魚(yú)（Poecilia reticulate,Guppy）隸屬于硬骨魚(yú)綱 （Class Actinopterygi）、形目 （Order Cyprinodontiformes）、 花科 （Family Poecili dae）、 花屬（Genus Poecilia）?？兹隔~(yú)對(duì)鹽度具有廣適性，可適應(yīng)海水和淡水[6]，近年來(lái)，孔雀魚(yú)的全基因組測(cè)序已完成[7]，因此，孔雀魚(yú)具有同時(shí)作為海水和淡水病原菌實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臐摿?。目前還鮮見(jiàn)將其用于水產(chǎn)病原學(xué)和免疫學(xué)的研究報(bào)道。

本研究將創(chuàng)傷弧菌以浸泡的方式感染孔雀魚(yú)，評(píng)價(jià)其對(duì)孔雀魚(yú)的致病力，同時(shí)，對(duì)感染后孔雀魚(yú)鰓免疫相關(guān)因子的表達(dá)情況進(jìn)行分析，以期建立以孔雀魚(yú)為模式動(dòng)物的海水病原菌感染模型和免疫研究模型。

1 材料與方法

1.1 材料 孔雀魚(yú)（1.0±0.2 g）來(lái)源于天津水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，購(gòu)自福州市花鳥(niǎo)市場(chǎng)。創(chuàng)傷弧菌FJ03-5X由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所分離保藏[8]。

1.2 孔雀魚(yú)的飼養(yǎng) 孔雀魚(yú)用淡水暫養(yǎng)于水體體積為200 L的PVC桶中，水溫25.0±0.5℃，溶氧6.0±0.3 mg/L，pH 值 7.5±0.3， 每天采用商品化餌料（Sera vipan staple diet D52518）投喂2次，投餌率1%。經(jīng)過(guò)2周暫養(yǎng)后，添加人工海鹽，使其鹽度為15‰，再經(jīng)1周暫養(yǎng)，添加海鹽，使其鹽度達(dá)到30‰。

1.3 感染試驗(yàn)

1.3.1 感染魚(yú)分組 孔雀魚(yú)在鹽度為30‰的水體中暫養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成4組，每組60尾，分別暫養(yǎng)于水體體積為100 L的PVC桶中，再經(jīng)1周暫養(yǎng)，用于感染試驗(yàn)。

1.3.2 菌株培養(yǎng) 將創(chuàng)傷弧菌FZ03-5X接種于TSA培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)12 h后，挑取單菌落，接種于10 mL TSB培養(yǎng)液，于28℃、160 r/min培養(yǎng)12 h后，取1 mL接種于100 mL TSB培養(yǎng)液；160 r/min培養(yǎng) 12 h后，28℃培養(yǎng) 12 h，以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，棄上清，沉淀用0.75%生理鹽水洗滌2次后，采用平板計(jì)數(shù)結(jié)合MeFarland比濁法，將菌用0.75%生理鹽水重懸至1.0×109CFU/mL，備用。

1.3.3 浸泡感染 將創(chuàng)傷弧菌FZ03-5X菌液用生理鹽水稀釋，將孔雀魚(yú)在3 L、鹽度為30‰的水體中以不同濃度的菌液進(jìn)行浸泡感染5 h，之后補(bǔ)充水體體積至100 L，持續(xù)觀察。各組的浸泡濃度見(jiàn)表1。

表1 各浸泡組菌液濃度

1.4 創(chuàng)傷弧菌感染后相關(guān)基因的表達(dá)分析

1.4.1 樣品采集 在浸泡感染15 d后，將菌液濃度為3.3×107CFU/mL的浸泡組和生理鹽水對(duì)照組的孔雀魚(yú)各取7尾，采集鰓絲用于相關(guān)基因的表達(dá)分析。

1.4.2 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 采用Trizol Reagent（Invitrogen）試劑盒，按說(shuō)明書(shū)提取鰓絲總RNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按試劑盒PrimeScript RT reagent Kit（Takara）說(shuō)明書(shū)操作，產(chǎn)物cDNA置于-20℃保存。

1.4.3 熒光定量PCR 采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GPDH）基因?yàn)閮?nèi)參基因，檢測(cè)C3補(bǔ)體、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白介素 10（Interleukin 10，IL-10）、 白介素 1 （Interleukin 1，IL-1）、Mx 蛋白（Mx-like）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、凋亡因子FAS和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）的表達(dá)情況，根據(jù)NCBI已報(bào)道的相關(guān)序列設(shè)計(jì)引物。引物由上海生工生物有限公司合成，序列見(jiàn)表2。內(nèi)參基因與目的基因各設(shè)3個(gè)平行反應(yīng)管。

表2 用于qPCR的引物

反應(yīng)體系為 25 μL，其中 12.5 μL SYBR Premix Ex Taq（Takara），上下游引物各 0.5 μL，稀釋 10 倍的cDNA 4 μL，加水至25 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在Bio-Rad公司的CFX-96上完成。反應(yīng)條件為95 ℃、90 s 后 ，95 ℃、5 s，60 ℃、15 s，72 ℃、20 s，40個(gè)循環(huán)，用比較 CT 方法(2-△△CTmethod)分析基因表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 創(chuàng)傷弧菌FZ03-5X對(duì)孔雀魚(yú)的致病力 試驗(yàn)魚(yú)死亡集中在浸泡后的前4 d，4 d后試驗(yàn)魚(yú)趨于平穩(wěn)，未再出現(xiàn)死亡。至感染后第15 d，菌液濃度為3.3×108CFU/mL的試驗(yàn)組死亡率為40%，菌液濃度為3.3×107CFU/mL的試驗(yàn)組死亡率為18.33% ，菌液濃度為3.3×106CFU/mL的試驗(yàn)組死亡率為13.33%，對(duì)照組死亡率為6.67%。說(shuō)明創(chuàng)傷弧菌以浸泡的方式感染孔雀魚(yú)可導(dǎo)致孔雀魚(yú)致病。具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 創(chuàng)傷弧菌FZ03-5X浸泡感染后各組魚(yú)的死亡曲線

2.2 創(chuàng)傷弧菌FZ03-5X感染后相關(guān)基因的表達(dá)情況 濃度為3.3×107CFU/mL的創(chuàng)傷弧菌浸泡組在感染15 d后，與免疫相關(guān)的腫瘤壞死因子（TNF），Mx因子表達(dá)水平均顯著高于生理鹽水對(duì)照組 （P＜0.05），白介素 10（IL-10）的表達(dá)水平與生理鹽水對(duì)照組無(wú)明顯差異 （P＞0.05），而超氧化物歧化酶（SOD）、白介素1（IL-1）的表達(dá)水平顯著低于生理鹽水對(duì)照組（P＜0.05），與細(xì)胞凋亡相關(guān)的凋亡因子FAS和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）的表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

3 討 論

水體是水產(chǎn)病原傳播的主要媒介，將病原以浸泡的方式感染宿主魚(yú)所獲得的數(shù)據(jù)能較真實(shí)地反映出臨床的實(shí)際情況。郭羿等用殺鮭氣單胞菌以創(chuàng)傷浸泡的方式感染大菱鲆致病，對(duì)體長(zhǎng)10～15 cm的大菱鲆LD50為6.3×104CFU/mL[9]。許斌福等用惡臭假單胞菌浸泡感染大黃魚(yú)，可使大黃魚(yú)致病，感染魚(yú)的肝、脾等內(nèi)臟器官出現(xiàn)了與臨床一致的白色結(jié)節(jié)，但單純的浸泡不易使魚(yú)致病[10]。本研究直接用創(chuàng)傷弧菌浸泡感染可使孔雀魚(yú)致病，說(shuō)明創(chuàng)傷弧菌對(duì)孔雀魚(yú)具有較強(qiáng)的致病力。

圖2 浸泡感染后相關(guān)因子的表達(dá)情況

養(yǎng)殖水體中水產(chǎn)病原菌含量不高，且細(xì)菌性疾病發(fā)病時(shí)的臨床表現(xiàn)非急性，因此，本研究在創(chuàng)傷弧菌浸泡感染孔雀魚(yú)15 d后對(duì)較低濃度感染組與對(duì)照組的免疫及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行比較，以期能獲得接近臨床的數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步開(kāi)展創(chuàng)傷弧菌與宿主魚(yú)的互作關(guān)系提供依據(jù)。

鰓是魚(yú)對(duì)外進(jìn)行物質(zhì)交換的主要器官，鰓是病原侵染的主要部位，同時(shí)鰓在魚(yú)類的非特異性免疫和特異性免疫中也發(fā)揮著重要作用[11]。陳營(yíng)等用綠色熒光蛋白標(biāo)記的嗜水氣單胞菌示蹤異育銀鯽對(duì)顆粒性菌體抗原的吸收途徑，結(jié)果表明鰓對(duì)抗原的吸收率高于體表和腸道[12]。Moore J D等用BSA乳膠顆粒浸泡虹鱒，發(fā)現(xiàn)鰓上抗原顆粒主要是由吞噬細(xì)胞攝取的，攝取的抗原在鰓中至少滯留24 d，并可向頭腎和脾臟轉(zhuǎn)移[13]。魚(yú)類的鰓存在由巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞組成的黏膜相關(guān)淋巴組織[14]，可獨(dú)立完成免疫應(yīng)答。因此，基于鰓的重要性，本研究以鰓為研究對(duì)象，對(duì)創(chuàng)傷弧菌侵染后相關(guān)因子的表達(dá)水平進(jìn)行分析。在感染15 d后，腫瘤壞死因子（TNF）、Mx因子、與細(xì)胞凋亡相關(guān)的凋亡因子FAS和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）的表達(dá)水平高于生理鹽水對(duì)照組，說(shuō)明在感染15 d后，感染魚(yú)仍存在炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)之所以能維持15 d，可能與創(chuàng)傷弧菌的持續(xù)感染有關(guān)。

本研究建立了創(chuàng)傷弧菌對(duì)孔雀魚(yú)的浸泡感染模型，掌握了創(chuàng)傷弧菌浸泡感染對(duì)孔雀魚(yú)的致病力數(shù)據(jù)，初步了解了創(chuàng)傷弧菌浸泡感染對(duì)鰓免疫及凋亡因子表達(dá)的影響，為今后進(jìn)一步開(kāi)展創(chuàng)傷弧菌與宿主魚(yú)的互作關(guān)系研究提供了理論依據(jù)，同時(shí)為開(kāi)展其他水產(chǎn)病原相關(guān)的研究提供了參考。