陳鑫珠, 高承芳, 劉 景*, 陳炳鈿, 黃勤樓, 黃秀聲, 翁伯琦*

(1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 福建 福州 350013； 2. 福建省新閩科生物科技開發(fā)有限公司博士后科研 工作站, 福建 福州 350008； 3. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)研究所, 福建 福州 350013)

21世紀(jì)以來，我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，飼料市場(chǎng)需求不斷提高，新型飼料開發(fā)顯得尤為重要[1]。近年來，我國(guó)食用菌的產(chǎn)量逐漸增加，使得菌糠(mushroom bran)的產(chǎn)量也隨之增加，這也使得開發(fā)菌糠飼料資源成為研究熱點(diǎn)[1]。青貯(silage)是將新鮮的牧草或秸稈等飼料作物，利用其表面附生的乳酸菌發(fā)酵成一種青綠多汁、耐貯存、可供動(dòng)物全年均衡營(yíng)養(yǎng)配方飼料的方法。國(guó)外對(duì)青貯研究的比較早，對(duì)一些青貯原料所含可溶性碳水化合物缺乏和附著在其上的乳酸菌數(shù)目不足是導(dǎo)致青貯失敗，開展了青貯劑的篩選、發(fā)酵效果及品質(zhì)評(píng)價(jià)等方面的研究[2]。綠汁發(fā)酵液(Fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria,FJLB) 是近年來新研發(fā)的一種新型生物性青貯添加劑，類似于乳酸菌制劑。其本質(zhì)是將植物勻漿后，利用其表面附生的乳酸菌在厭氧環(huán)境中將植物綠汁中的乳酸菌發(fā)酵富集，制成的一種青貯添加劑。其最大特點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)和環(huán)保，制作工藝流程簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、操作時(shí)安全，無污染，比一些商品乳酸菌制劑穩(wěn)定，且不受飼草生長(zhǎng)季節(jié)、水分含量及發(fā)酵溫度的影響[3]。近年來，逐漸成為研究的熱點(diǎn)。在青貯料中添加綠汁發(fā)酵液可以迅速降低pH值，提高乳酸含量，抑制梭菌活動(dòng)，減少低蛋白質(zhì)損失，且其添加效果不受青貯原料、DM含量及青貯條件影響[4]。添加綠汁發(fā)酵液可顯著地提高苜蓿青貯料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。Ohshima等[5]認(rèn)為，綠汁發(fā)酵液作用于苜蓿青貯不受收獲季節(jié)、生育期以及貯存溫度的影響，其青貯效果較好。但是，綠汁發(fā)酵液穩(wěn)定性較弱，不宜長(zhǎng)期保存，在實(shí)際大規(guī)模生產(chǎn)中使用較少，其優(yōu)劣性還有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)正是為探究影響其作用的微生物組成情況進(jìn)行分析，為探究其穩(wěn)定性影響因素奠定理論基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)培養(yǎng)法是經(jīng)典的微生物研究方法，但是在分子生物技術(shù)快速發(fā)展的今天，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法研究微生物群落結(jié)構(gòu)、種群多樣性及變化有其局限性，費(fèi)時(shí)和費(fèi)力，且結(jié)果片面，無法充分解析樣品中微生物的種類、豐度及其變化情況，低估了微生物的多樣性[6]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和更新?lián)Q代，16S rRNA克隆建庫(kù)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、脈沖電泳等方法也無法滿足科研分析的需要。基于微生物宏基因組學(xué)的高通量焦磷酸測(cè)序技術(shù)具有高通量、快速、省力等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸被廣泛應(yīng)用于土壤、腸道、水體、發(fā)酵食品等各微生態(tài)環(huán)境中微生物多樣性的檢測(cè)和研究，成為研究的熱點(diǎn)[7]。采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)和分析綠汁發(fā)酵液中微生物多樣性還未有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)利用宏基因組學(xué)技術(shù)，研究不同綠汁發(fā)酵液中的微生物多樣性，為全面了解不同綠汁發(fā)酵液中的微生物組成情況、有益微生物種類、提高青貯飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)和新方法；另外，本試驗(yàn)以菌糠為發(fā)酵原料，調(diào)制菌糠青貯飼料，為菌糠飼料的開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

菌糠：栽培平菇(Pleurotusostreatus)后的菌糠，由福建農(nóng)林大學(xué)菌草研究所提供。配方：五節(jié)芒(Miscanthusfloridulus(Labnll.)Warb)73% 麩皮25%，石灰2%，含水量60%。

紅象草(Pennisetumpurpureumred‘Red’)、甜玉米(ZeamaysL.)秸稈和葛藤(Puerarialobata(Willd.)Ohwi.)原料由泉頭牧草基地種植，甘蔗(Saccharumofficinarum)梢由市場(chǎng)購(gòu)買的果蔗取末梢2～3節(jié)。

1.2 綠汁發(fā)酵液的制作

2015年7月20日紅象草(Red elephant grass，PEG)、甜玉米秸稈(corn stalk，CS)、菌糠(mushroom residue，MB)、葛藤(kudzu，K)和甘蔗梢(sugarcane top，SC)。綠汁發(fā)酵液的制備參照Bureenok等報(bào)道的方法[8]。每個(gè)材料制備3瓶綠汁發(fā)酵液，即3個(gè)重復(fù)。

1.3 菌糠青貯飼料的制作

將采集到的菌棒破膜、搗碎、混合均勻。稱取18份500 g菌糠原料，分別裝入30 cm×45 cm自封袋中，試驗(yàn)自封袋貼好標(biāo)簽，分別均勻噴灑前期制作的五種綠汁發(fā)酵液(每種3個(gè)重復(fù)，共15份)，添加量為2 mL·kg-1綠汁發(fā)酵液+ 8 mL·kg-1蒸餾水，3份對(duì)照組處理噴灑等體積的蒸餾水，再充分混勻后裝入青貯袋中，抽真空、封口。放置室溫，發(fā)酵30開封。對(duì)照組和五種添加劑處理共6個(gè)處理18份，即每個(gè)處理3重復(fù)。

1.4 原料特性及發(fā)酵品質(zhì)的測(cè)定

原料分析樣本按常規(guī)方法測(cè)定水分和粗蛋白質(zhì)含量[9]；緩沖能的測(cè)定采用鹽酸、氫氧化鈉滴定法[10]；中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量的測(cè)定參照Van Soest方法[11]，半纖維素(hemicellulose，HC)=中性洗滌纖維-酸性洗滌纖維?？扇苄蕴妓衔?water soluble-carbohydrates，WSC)含量是用比色法[12]測(cè)定的。

分別采用MRS瓊脂培養(yǎng)基(MRS agar medium，MRS)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(Nutrient Agar，NA)計(jì)數(shù)發(fā)酵液上的乳酸菌。乳酸菌用厭氧箱(YQX-Ⅱ型，上海新苗)，37℃培養(yǎng)2 d。

青貯料開封后，攪拌均勻，每個(gè)樣本稱20 g放入聚乙烯塑料封口袋中，加入80 mL蒸餾水，放置4℃冰箱浸泡18 h后離心，用pH計(jì)(pH計(jì)：pHS-3B，上海鵬順科學(xué)儀器有限公司)測(cè)上清液的pH值；準(zhǔn)確量取10 mL上清液，采用凱氏定氮儀測(cè)定氨態(tài)氮(NH3-N)含量[9]；采用島津LC-20AT型高效液相色譜儀測(cè)定乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)和丁酸(butyrate acid，BA)含量。

WSC、NDF、ADF、HC、CP、LA、AA、PA和BA含量以干物質(zhì)基礎(chǔ)的百分比表示。

1.5 綠汁發(fā)酵微生物菌群分析

1.5.1綠汁發(fā)酵液總微生物菌體的收集將制備好的綠汁發(fā)酵液，搖勻后，取40 mL到滅菌后的離心管，1 000 rpm離心5 min，取上清液到另一只干凈的無菌管，12 000 rpm離心5 min，收集菌體沉淀。

1.5.2細(xì)菌基因組DNA的提取 每個(gè)菌體樣品按照FastDNA? SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals，Santa Ana，CA，美國(guó))試劑盒的說明，進(jìn)行發(fā)酵液總細(xì)菌基因組DNA的提取，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。

1.5.316S rDNA的擴(kuò)增和測(cè)序 使用上述提取的總DNA作為PCR的模板，利用特異性的引物對(duì)338F和 806R擴(kuò)增細(xì)菌 16S rDNA基因序列高變區(qū)V3～V4區(qū)，同時(shí)在前引物 5’端添加Barcode序列區(qū)分樣品[13]。每個(gè)樣品 3次重復(fù)，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。16S rRNA基因測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建和Illumina Miseq測(cè)序由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

1.6.1生物信息學(xué)分析 序列分析由QIIME軟件包和UPARSE pipeline完成。首先原始序列通過QIIME的默認(rèn)參數(shù)過濾掉低質(zhì)量的序列；然后利用UPARSE軟件生成OTU(Operational Taxonomic Units)(序列相似度≥97%)，利用RDP從每個(gè)OTU中選擇一條序列作為OTU代表；根據(jù)獲得的OTU數(shù)據(jù)，以測(cè)序樣本的序列數(shù)為橫坐標(biāo)，OTU值作為縱坐標(biāo)繪出每個(gè)樣品的稀釋曲線，同時(shí)根據(jù)樣本中所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目作OTU分布圖。稀釋曲線及α-多樣性的Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)等生物多樣性指數(shù)由mothur軟件平臺(tái)(version v. 1. 30. 1，http:/ /www. Mothur. org /wiki /Schloss _ SOP # Alpha _diversity)完成。熱圖(Heatmap)、主成分分析圖(PCA) 和冗余分析(RDA)采用R語言相關(guān)軟件包進(jìn)行分析作圖。

1.6.2青貯數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan法對(duì)均值進(jìn)行多重比較，對(duì)材料特性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 五種原料的化學(xué)成分及微生物組成

五種原料的化學(xué)成分及微生物組成見表1。菌糠的干物質(zhì)含量和粗脂肪含量顯著高于(P<0.05)其他4種原料，緩存能和半纖維素含量顯著(P<0.05)低于其他4種原料；葛藤pH值、緩沖能、粗蛋白含量顯著(P<0.05)高于其他4種原料，可溶性碳水化合物顯著(P<0.05)低于其他4種原料；甘蔗梢的半纖維素含量顯著(P<0.05)高于其他4種原料，粗脂肪含量顯著(P<0.05)低于其他4種原料；玉米秸稈和甘蔗梢的可溶性碳水化合物顯著(P<0.05)高于其他3種原料。5種原料微生物總量中，菌糠的乳酸菌、好氣性細(xì)菌、酵母菌和霉菌的數(shù)量顯著(P<0.05)低于其他4種原料。

表1 五種原料的化學(xué)成分及微生物組成Table 1 The chemical and microorganism composition of five materials

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)；下同

Note:Different lowercase letter in the same column indicated significant difference at the 0.05 level,the same as below

2.2 五種綠汁發(fā)酵液中的微生物OTU alpha多樣性分析

2.2.1五種綠汁發(fā)酵液中的多樣性指數(shù)分析 如圖1所示，Shannon稀釋曲線顯示曲線已經(jīng)趨于平坦，其覆蓋度均達(dá)到96%以上(表2)，表明樣本測(cè)序量已經(jīng)飽和，足夠反映樣本中絕大部分細(xì)菌物種的信息?；贠TU的結(jié)果，計(jì)算樣品的alpha豐富程度，葛藤和甘蔗梢綠汁發(fā)酵液的OTU數(shù)量，葛藤綠汁發(fā)酵液的Chao1和ACE值顯著(P<0.05)高于玉米秸桿、紅象草和菌糠綠汁發(fā)酵液，葛藤和菌糠綠汁發(fā)酵液的Shannon值和npShannon值顯著高于玉米秸稈和甘蔗梢綠汁發(fā)酵液，玉米秸稈和甘蔗梢的Simpson值顯著高于葛藤、紅象草和菌糠綠汁發(fā)酵液(表2)。葛藤綠汁發(fā)酵液的Chao1、ACE、Shannon和npShannon指數(shù)等指標(biāo)上均處在較高的水平，Simpson指數(shù)處在較低水平，說明葛藤綠汁發(fā)酵液的菌群數(shù)量較大，多樣性水平也相對(duì)較高。

圖1 樣品的shannon稀釋曲線圖Fig.1 Multy samples Shannon-wlener Curves注：corn，玉米秸稈；kudzu，葛藤；PEG，紅象草；MB，菌糠；SC，甘蔗梢；1，2，3，表示樣品的3個(gè)重復(fù)；下同Note:PEG,red elephant grass;MB,mushroom bran;SC,sugarcane;1,2,3 means three duplicates of the samples;The same as follow

表2 五種綠汁發(fā)酵液Alpha豐富程度表Table 2 The alpha diversity of five fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria

Number of OTUschao1ACEShannonnpShannonSimpsonCoverageCorn2711.33±58.18b6203.19±637.79c9622.11±943.20bc3.42±0.20c3.59±0.20c0.15±0.03a0.97Kudzu3580.67±74.14a7712.72±84.41a11865.80±303.76a4.02±0.25a4.19±0.27a0.10±0.02b0.96PEG2766.00±507.71b6258.08±1093.10bc9501.77±1573.24b3.86±0.09ab4.01±0.10ab0.09±0.02b0.97MB2877.33±230.97b6312.08±507.62bc9778.15±325.20b4.04±0.10a4.21±0.10a0.08±0.00b0.96SC3449.67±126.23a7405.40±37.40ab11128.47±146.83ab3.60±0.13bc3.77±0.12bc0.17±0.03a0.97F7.404.194.698.047.5810.02P0.010.030.020.000.000.00

2.2.2五種綠汁發(fā)酵液中微生物多樣性主成分分析 五種綠汁發(fā)酵液15個(gè)樣品的主成分分析見圖2。三個(gè)重復(fù)的樣品點(diǎn)聚集在一起，表示三個(gè)樣品重復(fù)性好。PC1的貢獻(xiàn)率為30.7%，PC2的貢獻(xiàn)率為25.9%。根據(jù)主成分分析，五組樣品大致可分為三類，紅象草和菌糠綠汁發(fā)酵液兩組樣品分別落在第一和第四象限，和其他組樣品的距離相對(duì)較遠(yuǎn)，單獨(dú)一類，甘蔗梢和玉米秸稈綠汁發(fā)酵液兩組樣品落在第二象限，葛藤落第三象限，三組樣品均分布在X軸附近，距離較近，歸類為一類。

圖2 樣品的PCA圖(OTU水平)Fig.2 Principal component analysis of microbial community of the samples (OUT level)

2.2.3五種綠汁發(fā)酵液中微生物多樣性熱圖分析 根據(jù)OTU的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，使用熱圖來展示不同的OTU在各樣品間的表達(dá)變化情況，同時(shí)可以根據(jù)熱圖上的聚類關(guān)系，也可以反應(yīng)樣本關(guān)系。因?yàn)镺TU的數(shù)目較多，且多數(shù)OTU豐度都很低(包含tags數(shù)量為1)，所以我們使用OTU至少在一個(gè)樣本中包含tags數(shù)量達(dá)到總tags數(shù)量的0.1%作為閾值，對(duì)滿足該條件的OTU進(jìn)行熱圖分析。圖3中五種綠汁發(fā)酵液的熱圖明顯呈現(xiàn)出五種原料微生物優(yōu)勢(shì)菌株的差異性。五種綠汁發(fā)酵液的3個(gè)重復(fù)均能較好的聚集在一起，說明樣品的重復(fù)性較好。玉米秸稈和甘蔗梢綠汁發(fā)酵液首先聚為一類，說明其二者菌群相似度較高，之后再與葛藤聚為一類；紅象草和菌糠綠汁發(fā)酵液?jiǎn)为?dú)聚為一類。

2.2.4五種綠汁發(fā)酵液中物種分類樹展示 根據(jù)物種的分類表達(dá)譜的數(shù)據(jù)，選取豐度較高的部分物種分類單元，我們做出了物種分類樹的展示圖。餅圖中不同的顏色的區(qū)域代表不同的樣品在該分類單元上的比率，半徑的大小代表該分類單元所包含的tag數(shù)占總tag的比例，半徑越大代表豐度越高，餅圖旁邊的百分比代表該分類單元的tag數(shù)占總tag數(shù)的百分比。

如圖4所示，綠汁發(fā)酵液微生物為細(xì)菌(99.804%)，主要為變形菌門(proteobacteria)(60.735%)的γ-變形菌綱Gamaproteobacteria(58.993%)和厚壁菌門(Firmicutes)(38.666%)的桿菌綱(Bacilli)(38.662%)。γ-變形菌綱主要是假單胞菌目(Pseudomonadales)(13.861%)下假單胞細(xì)菌科(Pseudomonadaceae)(13.475%)的假單胞屬(Pseudomonas)(11.952%)和腸桿菌目(Enterobacteriales)(43.846%)下腸桿菌科(Enterobacteriaceae)(43.846%)的歐文氏菌屬(Erwinia)(7.556%)、克雷白氏桿菌屬(Klebslella)(12.128%)、沙雷氏菌屬(Serratia)(11.952%)、檸檬酸細(xì)菌屬(Citobacter)(1.467%)、沙門氏菌(Salmenella)(6.450%)和腸桿菌屬(Enterobacter)(0.303%)；桿菌綱主要是桿菌目(Lactobacillales)(38.075%)明串珠菌科(Leuconostocaceae) 的明串珠菌屬(Leuconostoc)(30.751%)和魏斯氏菌屬(Weissella)(1.45%)，以及鏈球菌科(Streptococcaceae)(7.153%)的乳球菌屬Lactococcus(7.117%)。其中玉米秸稈綠汁發(fā)酵液中克雷白氏桿菌屬和明串珠菌屬比例較高，菌糠綠汁發(fā)酵液中檸檬酸細(xì)菌屬、沙門氏菌和腸桿菌屬比例較高，葛藤和紅香草綠汁發(fā)酵液中乳球菌屬比例較高，另外葛藤綠汁發(fā)酵液中腸桿菌屬比例較高。

圖3 樣品OTU表達(dá)譜熱圖Fig.3 OTU heat map of samples

圖4 樣品菌群的發(fā)育樹Fig.4 Species classification tree of samples

2.3 不同水平下微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1基于目水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析 五種綠汁發(fā)酵液基于目水平下的微生物群落結(jié)構(gòu)見圖5(豐度>1%)。圖5顯示了15個(gè)樣本共鑒定出60個(gè)目，豐度大于1%的目只有4個(gè)，總豐度分別占98.47%(玉米秸稈)，97.43%(葛藤)，97.15%(紅象草)，96.82%(菌糠)和96.07%(甘蔗梢)，其中乳酸桿菌目(Lactobacillales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)和假單胞菌目(Pseudomonadales)為優(yōu)勢(shì)菌目，伯克霍爾德氏菌目(Burkholderiales)在各組樣品中占的比例較低，另外還有一些無類別的(Unclassified)和其他(Other)細(xì)菌。不同原料所制得綠汁發(fā)酵液目水平的微生物分布比例差異明顯。玉米秸稈和紅象草綠汁發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌目為腸桿菌目和乳酸桿菌目，分別占48.34%和35.73%；葛藤綠汁發(fā)酵液中乳酸桿菌目、腸桿菌目和假單胞菌目三者為優(yōu)勢(shì)菌目，分別占35.52%、31.50%和29.61%；菌糠綠汁發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌目為腸桿菌目，占71.48%；甘蔗梢綠汁發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌目為乳酸桿菌目，占59.07%，另外腸桿菌目其占25.89%。

圖5 基于目水平的樣本微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.5 Microbial community structure of sample on the order level注：堆疊圖展示至少在一個(gè)樣本中的表達(dá)豐度達(dá)到1%的物種，達(dá)不到1%的物種統(tǒng)一歸類到Other類別中去，無法注釋到該水平的tags則被歸類到Unclassified類別中去；下同Note:The stack diagram shows the species that expression abundance reached 1%,the species less than 1% were classified into Other categories,the tags unable to comment are classified into the Unclassified category;The same as below

2.4.2基于科水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析 五種綠汁發(fā)酵液基于科水平下的微生物群落結(jié)構(gòu)見圖6(豐度>1%)。圖6顯示了15個(gè)樣本共鑒定出90個(gè)科，豐度大于1%的科只有4個(gè)，分別為明串珠菌科(Leuconostocaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)和鏈球菌科(Streptococcaceae)，另外還有一些無類別的(Unclassified)和其他(Other)細(xì)菌。4個(gè)科的菌總豐度分別為97.41%(玉米秸稈)，95.61%(葛藤)，95.89%(紅象草)，94.54%(菌糠)和93.28%(甘蔗梢)。不同原料所制得綠汁發(fā)酵液不同科水平的微生物分布比例有明顯差異。玉米秸稈綠汁發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌科為明串珠菌科和腸桿菌科，分別占32.86%和48.34%；葛藤綠汁發(fā)酵液中明串珠菌科、腸桿菌科和假單胞菌科三者為優(yōu)勢(shì)菌目，分別占34.70%、31.50%和28.90%；紅象草和菌糠綠汁發(fā)酵液中腸桿菌科為優(yōu)勢(shì)菌科，分別占53.02%和71.48%；甘蔗梢綠汁發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌目為明串珠菌科，占59.07%，另外腸桿菌目其占25.89%。

圖6 基于科水平的樣本微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.6 Microbial community structure of sample on the family level

2.4.3基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析 五種綠汁發(fā)酵液基于屬水平下的微生物群落結(jié)構(gòu)見圖7(豐度>1%)。圖7顯示了15個(gè)樣本共鑒定出129個(gè)屬，豐度大于1%的屬有9個(gè)，分別為明串珠菌屬(Leuconostoc)、魏斯氏菌屬(Weissella)、乳球菌屬(Lactococcus)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)和假單胞菌屬(Pseudomonas)，另外還有一些無類別的(Unclassified)和其他(Other)細(xì)菌。9個(gè)屬菌總豐度分別為85.40%(玉米秸稈)，60.15%(葛藤)，77.74%(紅象草)，72.68%(菌糠)和42.31%(甘蔗梢)，葛藤和甘蔗梢綠汁發(fā)酵液中含有較大比例無法注釋的菌屬。不同原料所制得綠汁發(fā)酵液菌屬種類和分布比例有顯著差異。在可注釋的這些菌屬中，玉米秸稈綠汁發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌屬為明串珠菌屬(29.81%)、克雷白氏桿菌屬(31.96%)和假單胞菌屬(11.85%)，另外，與青貯相關(guān)的乳球菌屬占2.75%；葛藤綠汁發(fā)酵液中優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬(26.82%)，明串珠菌屬(6.97%)、魏斯氏菌屬(2.21%)和沙門氏菌屬(1.80%)；紅象草綠汁發(fā)酵液中乳球菌屬(28.12%)和沙雷氏菌屬(23.08%)為優(yōu)勢(shì)菌屬，另外，與青貯相關(guān)的明串珠菌屬占10.17%；菌糠綠汁發(fā)酵液優(yōu)勢(shì)菌屬為沙門氏菌屬占31.71%，另外，與青貯相關(guān)的明串珠菌屬占6.09%；甘蔗梢綠汁發(fā)酵液中50%以上菌屬無法注釋，含有與青貯相關(guān)的菌屬有明串珠菌屬(9.43%)、乳球菌屬(3.44%)和魏斯氏菌屬(2.71%)。

2.4 五種綠汁發(fā)酵液對(duì)菌糠發(fā)酵品質(zhì)的影響

2.4.1五種綠汁發(fā)酵液對(duì)菌糠發(fā)酵料干物質(zhì)、氨態(tài)氮和pH的影響 五種綠汁發(fā)酵液對(duì)菌糠干物質(zhì)、氨態(tài)氮和pH的影響見圖8。各處理組干物質(zhì)含量與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)，菌糠綠汁發(fā)酵液處理組的干物質(zhì)含量顯著(P<0.05)高于紅象草、葛藤和甘蔗梢綠汁發(fā)酵液組；與對(duì)照組相比，菌糠綠汁發(fā)酵液處理組的氨態(tài)氮含量顯著(P<0.05)降低；與對(duì)照組相比，五種綠汁發(fā)酵液組的pH顯著(P<0.05)降低，紅象草綠汁發(fā)酵液處理組的pH顯著(P<0.05)低于其他處理組。

2.4.2五種綠汁發(fā)酵液對(duì)菌糠發(fā)酵料有機(jī)酸的影響 五種綠汁發(fā)酵液對(duì)菌糠發(fā)酵料有機(jī)酸的影響見圖9。與對(duì)照組相比，五種綠汁發(fā)酵液處理組青貯料的乳酸含量顯著(P<0.05)升高，丁酸含量顯著(P<0.05)降低；除紅象草綠汁發(fā)酵液處理組外，其他四種綠汁發(fā)酵液處理組的乙酸含量顯著(P<0.05)降低；紅象草綠汁發(fā)酵液處理組的丙酸含量顯著(P<0.05)降低。

圖7 基于屬水平的樣本微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.7 Microbial community structure of sample on the genus level

圖8 五種綠汁發(fā)酵液對(duì)干物質(zhì)含量、氨態(tài)氮含量和pH值的影響Fig.8 The effect of five fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria on dry matter content,ammonia-N content and pH value注：CK，對(duì)照組；PEG，紅象草綠汁發(fā)酵液處理組；Corn，玉米綠汁發(fā)酵液處理組；MB，菌糠綠汁發(fā)酵液處理組；Kudzu，葛藤綠汁發(fā)酵液處理組；SC，甘蔗梢綠汁發(fā)酵液處理組；不同字母表示差異顯著(P<0.05)；下同Note:CK,control;PEG,adding red elephant grass fermented juice of epiphytic lactic acid bacteria (FJLB) group;MB,adding mushroom bran FJLB group;Kudzu,adding kudzu FJLB group;SC,adding sugarcane FJLB group;Different lowercase letter indicated significant difference at the 0.05 level (P<0.05);The same as below

圖9 五種綠汁發(fā)酵液對(duì)有機(jī)酸的影響Fig.9 The effect of five fermented juice of epiphytic LAB on the contents of organic acid

2.5 冗余分析

采用冗余分析綠汁發(fā)酵液乳酸菌菌屬與青貯發(fā)酵產(chǎn)物的相關(guān)性等結(jié)果見圖10。pH、氨態(tài)氮坐落在第一現(xiàn)象，與分布在第一象限的腸球菌屬、魏斯氏菌屬和乳桿菌屬呈銳角，為正相關(guān)；丁酸在第二象限，與分布在第二象限和第三現(xiàn)象的片球菌屬和明串珠菌屬呈銳角，為正相關(guān)，且射線較長(zhǎng)，相關(guān)系數(shù)較高；乳酸和乙酸在第三象限，與分布在第三象限的明串珠菌屬、Y軸負(fù)半軸的鏈球菌屬和第四象限的乳球菌屬呈正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)較高；干物質(zhì)和丙酸分布在第四象限，與Y軸負(fù)半軸的鏈球菌屬和第四象限的乳球菌屬呈正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)較高。

采用冗余分析綠汁發(fā)酵液乳酸菌菌種與青貯發(fā)酵產(chǎn)物的相關(guān)性等結(jié)果見圖11。腸系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)的射線最長(zhǎng)，對(duì)青貯有機(jī)酸的影響最大。丁酸和乳酸在第一象限，與腸系膜明串珠菌呈銳角，為正相關(guān)；氨態(tài)氮在第二象限，靠近X軸負(fù)半軸，與附近的嗜酸球菌(Pedococcusacidilactici)、干酪腸球菌(Enterococcuscasselillvus)、細(xì)辛腸球菌(Enterococcusasini)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、葡萄魏氏菌(Weissellaviridescens)和格氏乳球菌(Lactococcusgarviease)呈銳角，為正相關(guān)；pH在第三現(xiàn)象，與第三象限上的嗜酸球菌、干酪腸球菌、細(xì)辛腸球菌、短乳桿菌、葡萄魏氏菌、硫腸球菌(Enterococcussulfureus)和格氏乳球菌呈銳角，為正相關(guān)；干物質(zhì)、乙酸和丙酸在第四象限，與無乳鏈球菌呈銳角，為正相關(guān)。

圖10 屬水平上的RDA分析Fig.10 RDA analysis on the genus level

圖11 種水平上的RDA分析Fig.11 RDA analysis on the specie level

3 討論

青貯主要是利用原來中的乳酸菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵，使的青貯料成為一個(gè)酸性環(huán)境，而酸性環(huán)境能夠有效抑制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而保存原料的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[14-17]。許多原料附生的乳酸菌數(shù)量較少，添加乳酸菌制劑是人工擴(kuò)大青貯原料中乳酸菌群體的有效方法[18-19]。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)原料菌糠中的乳酸菌數(shù)量較少，僅2.23 lg cfu·g-1FM。一般來說，使乳酸菌迅速增殖并占主導(dǎo)地位的原料中，乳酸菌的有效濃度以105·g-1鮮草為標(biāo)準(zhǔn)值[20]。本試驗(yàn)菌糠原料遠(yuǎn)低于這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)值，因此必須采用人工添加乳酸菌制劑的方法進(jìn)行發(fā)酵。綠汁發(fā)酵液是人工制成的一種新型的純天然的青貯添加劑。Naoki[4]，Ohshima[21]等報(bào)道在青貯料中添加綠汁發(fā)酵液可以迅速降低青貯料的pH值，提高乳酸含量，抑制梭菌活動(dòng)，減少蛋白損失，且其添加效果不受青貯原料、收獲季節(jié)、生育期、干物質(zhì)含量及青貯條件影響，其青貯效果較好。鄭丹等[22]表明，添加綠汁發(fā)酵液后促進(jìn)同質(zhì)乳酸菌的發(fā)酵，有效地抑制了丁酸菌及其他有害微生物活性，減少了蛋白質(zhì)的分解，提高了乳酸菌對(duì)水溶性碳水化合物的利用效率及雜交狼尾草青貯發(fā)酵品質(zhì)。本試驗(yàn)也獲得相似結(jié)果，五種綠汁發(fā)酵液能夠有效的改善菌糠的發(fā)酵品質(zhì)，提高菌糠青貯料的乳酸含量，降低了其pH值、乙酸含量和丁酸的含量。這與Shao[23]在黑麥草中，許慶芳[24]等在苜蓿中，葉杭等[25]香蕉葉中添加綠汁發(fā)酵液的效果相似。

綠汁發(fā)酵液其實(shí)質(zhì)是人工培養(yǎng)法對(duì)原料表面附生的乳酸菌在無氧條件下進(jìn)行自然富集，因此可作為乳酸菌菌劑的替代物。Cai等報(bào)道[26]，與青貯密切相關(guān)的乳酸菌主要是乳桿菌屬(Lactobacillus)，片球菌屬(Pediococcus)，腸球菌屬(Enterococcus)，明串珠菌屬(Leuconostoc)，乳球菌屬(Lactococcus)，鏈球菌屬(Streptococcus)，魏斯特菌屬(Weissella)。這些菌屬中的菌株能夠在厭氧條件下，進(jìn)行乳酸發(fā)酵，產(chǎn)生乳酸，降低青貯料的pH值，從而抑制一些需氧的不良細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，保存青貯料的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。本試驗(yàn)對(duì)菌屬與青貯發(fā)酵品質(zhì)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析的冗余分析結(jié)果中射線較長(zhǎng)，與菌糠青貯發(fā)酵關(guān)系較大的是菌屬為片球菌屬、明串珠菌屬、鏈球菌屬和乳球菌屬。高通量測(cè)序結(jié)果中，玉米秸稈綠汁發(fā)酵、葛藤綠汁發(fā)酵液、紅象草綠汁發(fā)酵液、菌糠綠汁發(fā)酵液和甘蔗梢綠汁發(fā)酵液中相關(guān)的菌株占得比例為32.56%(明串珠菌屬29.81%和乳球菌屬2.75%)、9.18%(明串珠菌屬6.97%和魏斯氏菌屬2.21%)、38.29%(乳球菌屬28.12%和明串珠菌屬10.17%)、6.09%(明串珠菌屬6.09%)和15.58%(明串珠菌屬9.43%、乳球菌屬3.44%和魏斯氏菌屬2.71%)，這個(gè)結(jié)果中紅象草綠汁發(fā)酵液中與青貯有關(guān)的乳酸菌屬占的比例最高，在紅象草綠汁發(fā)酵液液中占據(jù)了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的比例，這應(yīng)該是其在6個(gè)處理組中獲得最低pH值和最高的乳酸含量，效果最佳的主要原因。綠汁發(fā)酵液中含有許多有其他菌屬的細(xì)菌，其中歐文氏菌屬為兼性好氣菌，代謝為呼吸型或發(fā)酵型，pH值5.3～9.2均可生長(zhǎng)，最適pH值 7.2；克雷白氏菌屬為兼氣性厭氧菌，若pH值低于6.0或高于8.0則生長(zhǎng)緩慢；沙門氏菌，為兼性厭氧，最佳pH值為6.5～7.5；沙雷氏菌屬為兼性厭氧，幾乎所有的菌株能在pH 5～9下生長(zhǎng)[27]。這些菌株均為兼性厭氧，在發(fā)酵初期會(huì)與青貯相關(guān)的乳酸菌進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，只有當(dāng)青貯料的pH降到5.0以下時(shí)，其生長(zhǎng)才被抑制，因此，這些菌占比例較大時(shí)，其添加效果就不穩(wěn)定，具體體現(xiàn)在玉米秸稈綠汁發(fā)酵液中，其與青貯有關(guān)的乳酸菌占32.56%的比例，但僅克雷白氏桿菌屬占31.96%，因此無法突出乳酸菌優(yōu)勢(shì)菌群的效果。而假單胞菌屬，這些菌專性需氧的革蘭氏染色陰性無芽胞、有莢膜桿菌，不發(fā)酵糖類，pH值低于5.0或高于9.0則基本不生長(zhǎng)[27]，因此其對(duì)青貯發(fā)酵影響不大，并且這些菌屬許多為專性需氧菌，在厭氧條件下其生長(zhǎng)被抑制[28]，而與青貯相關(guān)的乳酸菌為厭氧菌，在厭氧的條件的，能夠迅速生長(zhǎng)繁殖，迅速提高其在發(fā)酵料中的的比例，正面影響青貯發(fā)酵進(jìn)程。這可能就是葛藤綠汁發(fā)酵液中，雖然假單胞菌屬占最高比例，是葛藤綠汁發(fā)酵液的優(yōu)勢(shì)菌，但葛藤綠汁發(fā)酵液的添加效果卻僅次于紅象草綠汁發(fā)酵液的原因。近年來，一些報(bào)道表示綠汁發(fā)酵液的使用存在不穩(wěn)定，通過本試驗(yàn)結(jié)果可表明，其主要原因是其中與青貯相關(guān)的乳酸菌屬所占比例較低，其他兼性厭氧菌屬占比例較高造成的。冗余分析的結(jié)果也證明，正是這些菌屬的不同，造成青貯品質(zhì)的差異。本試驗(yàn)中，在綠汁發(fā)酵液中，嗜酸球菌、干酪腸球菌、細(xì)辛腸球菌、短乳桿菌、葡萄魏氏菌和格氏乳球菌等菌株與青貯料的pH值和氨態(tài)氮有密切的相關(guān)性，這些菌株在乳酸菌商品添加劑中較為常用的菌株，已經(jīng)有較肯定的效果，然而腸系膜明串珠菌和無乳鏈球菌與對(duì)青貯發(fā)酵產(chǎn)物中的乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的產(chǎn)生有較大的相關(guān)性，目前對(duì)這兩株菌在青貯的的應(yīng)用研究較少報(bào)道，需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

5種綠汁發(fā)酵液均能夠顯著提高青貯料的乳酸含量，顯著降低青貯料的丁酸含量，提高菌糠青貯料的發(fā)酵品質(zhì)。不同原料制備的綠汁發(fā)酵中微生物種群分布有明顯差異，在青貯發(fā)酵中，效果不完全不同。本試驗(yàn)五種綠汁發(fā)酵液中，紅象草綠汁發(fā)酵液與青貯相關(guān)的乳酸菌比例最高，在6個(gè)處理組中獲得最低pH值和最高的乳酸含量，效果最佳。通過Miseq高通量測(cè)序技術(shù)分析，能夠清楚的解析綠汁發(fā)酵液中微生物的分布情況，闡明綠汁發(fā)酵液中微生物的分布與青貯料品質(zhì)的關(guān)系。