朱哲逸 張彩娟 徐青青 朱宗河

摘? 要：以甘藍型油菜天禾油10號及其父母本為材料，利用SSR分子標記方法對天禾油10號雜交制種待測樣品進行了鑒定分析。結果表明，利用引物CB10036、CN48鑒定待測樣品144棵單株，純度為67.08%，同批次待測樣大田種植鑒定純度為70.2%，兩種方法鑒定結果基本一致，說明引物CB10036、CN48可用于天禾油10號的室內純度快速鑒定。

關鍵詞：油菜;SSR分子標記技術;天禾油10;純度

中圖分類號 S565.4文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）04-0016-03

中國是油菜生產大國，種植總面積和總產均占世界30%左右[1]。甘藍型雜交油菜超親優(yōu)勢明顯，達20%～30%[2]，其群體純度即雜種群體的非雜種植株的多少，是影響群體產量的重要因素之一[3]。為降低雜交油菜制種風險，需要快速、準確、有效地鑒定雜交油菜品種的純度[4]。雜交油菜品種傳統(tǒng)的純度鑒定方法主要是大田種植鑒定[5]，但完全依據大田種植鑒定需要異地種植，周期較長[6]。采用同工酶技術鑒定雖然鑒定時間較短，但難以區(qū)分親緣關系較近的雜交種[7]。由于SSR標記鑒定技術能體現出同一位點在不同個體之間的多態(tài)性，并且數量豐富，擴增穩(wěn)定，擴增譜帶少，易于檢測，具有共顯性、重復好、多態(tài)性豐富以及簡單快捷易于掌握等特點，近年來已大量用于雜交油菜的純度鑒定中[8-19]。本研究探索利用SSR分子標記技術對國審雜交油菜品種天禾油10號大田生產的雜交種純度進行鑒定，輔助田間種植鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料為國審油菜品種天禾油10號及其親本不育系5C650和恢復系R161。親本種子及天禾油10號雜交種由天禾科技集團股份有限公司提供。

1.1.1 取樣 雜交種天禾油10號純度待測樣取自安徽和縣制種田，制種田于2016年9月播種，收獲前在代表性制種田采取“Z”形選取樣株。各取樣株主軸、一次分枝、二次分枝角果數按1∶1∶1取樣，每株取12個角果，共取1000個角果。取樣角果45℃烘箱烘干后脫粒后，所取純度待測樣種子混勻后一分為二，1份于2017年5月15日帶到青海進行種植鑒定，1份發(fā)芽后進行室內SSR純度鑒定。室內鑒定于2017年12月至2018年2月在安徽農業(yè)大學生物科技樓進行。

1.1.2 引物來源 SSR引物和DNA聚合酶購自上海生工，引物序列源于中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準《甘藍型油菜品種鑒定技術標準SSR標記法》（NY/T 2468-2013）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 在12cm×12cm×6cm的發(fā)芽盒中放2層發(fā)芽紙，噴蒸餾水充分濕潤發(fā)芽紙，在發(fā)芽紙上均勻點上親本及雜交種，光照發(fā)芽箱室溫下發(fā)芽7d。選取150株雜交種幼苗，分單株提取DNA，各取5個父、母本單株的幼嫩子葉混合磨樣后提取DNA。DNA提取方法參照陸光遠等的CTAB法[20]。

1.2.2 擴增反應 將-20℃保存的雜交種及親本DNA稀釋至30ng·μL-1進行PCR擴增。10μLPCR反應體系為：DNA1μL，dNTPs0.1μL，含Mg2+緩沖液1μL，Taq酶0.1μL，上下游引物各0.5μL，加超純水至10μL。體系配置完成后加入甘油封口，PCR按如下程序進行：94℃、5min;1個循環(huán);94℃、1min;60℃、30s，每循環(huán)降0.5℃;72℃、45s，以上梯度進行10個循環(huán);94℃、1min;55℃、30s;72℃、45s以上梯度進行30個循環(huán);最后72℃、8min;4℃保存。

1.2.3 擴增產物檢測 擴增產物4℃冷藏備用。SSR擴增產物加1/2體積的變性上樣緩沖液，95℃變性5min后立即冷卻，然后在8%的變性聚丙烯酰胺凝膠上85W恒功率電泳1.5h。電泳結束后，變性凝膠用10%冰醋酸溶液固定、水洗，并用0.1%的硝酸銀溶液染色，1.5%NaOH溶液顯色，再用10%冰醋酸溶液終止顯影，漂洗并風干，拍照并記錄擴增條帶結果。

1.2.4 SSR純度鑒定 按照種子純度計算公式P（%）=C/T×100（P為純度，C為同時具有雙親特征譜帶的樣本數，T為待測樣品植株總數。統(tǒng)計并計算雜效種純度，比較SSR純度鑒定與大田種植鑒定的結果，確定SSR純度鑒定的有效性

1.2.5 田間種植鑒定 田間種植鑒定于2017年5—8月在青海省海東市平安區(qū)安徽省北繁中心試驗地進行。鑒定樣播20行/區(qū)，2m/行，每行播100粒種子，按同樣密度及播量播種少量標準雜交種作對照，生產期間不間苗。在盛花期，調查不育株及與標準雜交株有明顯區(qū)別的異型株。田間鑒定純度（%）=（待測樣調查總株數一不育株數-異型株）×100/待測樣調查總株數。

2 結果與分析

2.1 SSR引物篩選 使用《甘藍型油菜品種鑒定技術標準SSR標記法》（NY/T 2468-2013）中47對SSR引物對天禾油10號標準雜交種及其親本進行PCR擴增，篩選出2對在標準雜交種的父母間差異明顯并在雜交種呈現出清晰雙親互補特征條帶的引物（見表1），用于天禾油10號雜交種的純度快速檢測。

2.2 SSR鑒定結果 根據待測雜交種及親本的擴增結果，統(tǒng)計同時具有雙親特征譜帶的樣本株數。引物CB10036擴增的單株有效株數為143株，其中同時具有雙親特征譜帶的真雜種樣本株數為91株;根據純度計算公式，計算出天禾油10號雜交種的純度為63.64%，引物CN48擴增的單株有效株數為142株，其中同時具有雙親特征譜帶的真雜種樣本株數為100株;計算天禾油10號雜交種的純度為70.42%。2對引物鑒定天禾油10號的平均純度為67.08%。

2.3 田間種植鑒定結果 大田調查945株，其中雜交種有663株，母本自交種282株，根據純度計算公式計算，雜交種的純度為70.2%，假雜種全部為母本自交種子。

3 討論與結論

為簡化雜交油菜SSR純度室內鑒定的程序，本研究未進行SSR引物篩選，而是從油菜SSR核心引物中隨機選擇了CB10036和CN48這2對引物對天禾油10號的父母本及雜交種進擴增，結果表明，2對隨機選擇引物都能準確區(qū)分出待測樣中的真雜種及混雜的父母本，2對引物擴增結果都具有很好的一致性，且2對引物鑒定天禾油10號待測樣純度鑒定結果也相近。說明SSR標記有穩(wěn)定的共顯性，可以用來鑒定甘藍型油菜的雜交種。

通過對天禾油10號純度的室內SSR鑒定與田間種植鑒定的結果進行比較可知，2種方法用于天禾油10號的純度鑒定結果基本一致，都可以用于天禾油10號的純度鑒定。室內SSR鑒定能將待測樣真雜種中混雜的父本、母本、異品種通過擴增條帶與真雜種區(qū)別開來，而田間種植鑒定，通常只鑒定待測樣中的母本株，因此同一待測樣純度室內SSR鑒定結果往往略低于田間種植鑒定。

參考文獻

[1]Fu T.D.，Yang G.S.，Tu J.X..The present and future of rapeseed production in China Proceedings of International Symposium on Rapeseed Science.Science Press NeW York，Ltd，2001，3-5.

[2]傅廷棟，涂金星.油菜雜種優(yōu)勢利用的現狀與展望[G]//劉后利.作物育種學論叢.北京：中國農業(yè)大學出版社，2002：235-250.

[3]傅廷棟.雜交油菜的育種與利用[M].武漢：湖北科學技術出版社.2000，194-195.

[4]劉靜，董振生，李紅兵.白雜1號種子純度的RAPD鑒定技術研究[J].西北農林學報，2007，16（1）：131-135.

[5]劉梓諭，王新發(fā)，劉貴華，等.三個高含油量甘藍型油菜新品種系SSR指紋圖譜的構建[J].中國油料作物學報，2008，30（4）：389-396.

[6]孟倩，董軍剛，葛娟，等.甘藍型油菜‘西農18種子純度的SSR鑒定[J].中國農學通報，2013，29（3）：153-156.

[7]梅德圣，李云昌，李英德，等.用酯酶同工酶和AFLP標記鑒定甘藍型油菜中油雜2號的種子純度[J].江西農業(yè)大學學報，2005，27（1）：59-62.

[8]宋賢勇，包月紅，楊俊濤，等.利用SSR標記鑒定甘藍型油菜秦優(yōu)11號種子純度[J].分子植物育種，2010，8（3）：497-500.

[9]曲亮，陳衛(wèi)江，李莓，等.SSR標記技術在甘藍型油菜雜交種純度鑒定中的應用[J].湖南農業(yè)大學學報（自然科學版），2009，35（3）：229-232.

[10]李保軍，王灝，王愛娜，等.應用SSR鑒定化學殺雄雜交油菜秦雜油19種子純度的研究[J].分子植物育種，2013，11（4）：517-524

[11]薛艷，李英，張星，等.鑒定甘藍型油菜雜交種種子純度的SSR分子標記引物篩選[J].種子，2017，36（6）：125-127.

[12]史慧娟，趙昭，陽治國，等.甘藍型油菜均隆油5號特征指紋圖譜構建和雜種純度鑒定[J].種子，2014，33（8）：16-20

[13]陳鋒 張潔夫，陳松浦，等.雜交油菜寧雜11號種子純度SSR標記快速檢測方法[J].分子植物育種，2013，11（4）：600-604.

[14]盧虹，徐愛遐.SSR分子標記技術在甘藍型油菜雜交種陜油16純度鑒定中的應用在甘藍型油菜雜交種陜油16純度鑒定中的應用[J].種子，2016（6）：123-126.

[15]沈金雄，傅廷棟，楊光圣.甘藍型油菜SSR、ISSR標記的遺傳多樣性及其與雜種表現的關系[J].中國農業(yè)科學，2004，37（4）：477-483.

[16]Piquemal J，Cinquin E，Couton F C，et al.Construction of an oilseed rape（Brassica napus L）genetic map With SSR markers[J].Theor A ppl Genet.，2005（111）：1514-1523.

[17]周紅偉，姚艷梅，付忠，等.春性雙低甘藍型油菜雜交種和親 本指紋圖譜構建及雜交種純度鑒定[J].西北農業(yè)學報，2010，19（3）：81-86.

[18]王同華，陳衛(wèi)紅，李莓，等.基于SSR標記技術的油菜雜交品種灃油958的種子純度鑒定[J].現代農業(yè)科技，2014，18：20-25.

[19]穆建新，李殿榮，郭藹光，等.用SSR分子標記檢測雜交油菜秦優(yōu)7號的種子純度[J]西北農業(yè)學報，2010，19（11）：64-68.

[20]陸光遠，伍曉明，張冬曉，等.SSR標記分析國家油菜區(qū)試品種的特異性和一致性[J].中國農業(yè)科學，2008，41（1）：32-42.

（責編：張宏民）