張海瑞，王中鐸，黃順楷，汪 淳，郭昱嵩，董忠典，劉楚吾

（廣東海洋大學水產(chǎn)學院 / 南海水產(chǎn)經(jīng)濟動物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524025）

青鳉屬魚類在我國分布廣泛，有記錄為中華青鳉 （Oryzias sinensis）、小青鳉（O.minutillus）、弓背青鳉（O.curvinotus）、鰭斑青鳉(O.pectoralis)[1]，而日本青鳉（O.latipes）可能是中華青鳉的誤記[2-3]。青鳉屬魚類體型小，飼養(yǎng)方便，繁殖力強且周期短，胚胎透明，是研究發(fā)育生物學、環(huán)境毒理學的重要模式生物[4-5]。其對鹽度和溫度適應性廣[6]，可耐受低溶氧，生命力強，疾病少，可通過控制溫度和光照周期使其全年產(chǎn)卵[7]，且卵大透明，在顯微注射和細胞移植等方面具有獨特優(yōu)勢，是進行基因功能研究的理想材料[8]。由于青鳉屬魚類的早期階段對污染物最為敏感，被廣泛應用于檢測環(huán)境內(nèi)分泌干擾物、致癌污染物等[9-10]，是環(huán)境毒理學研究的重要模型動物。海水青鳉（O.melastigma）被認為是典型的胚胎毒性分析種類[10]，日本青鳉已被國際標準化組織推薦為毒性試驗的標準用魚之一[11]。

弓背青鳉隸屬于輻鰭亞綱（Actinopterygii）頜針魚目（Beloniformes）怪頜鳉科（Adrianichthyidae）青鳉屬（Oryzias），在我國廣東沿海分布廣泛，其性別分化明顯，發(fā)育早期既可用少量鰭條DNA通過性別特異性分子標記快速、準確地鑒定遺傳性別[12]，而成年魚的性別可結(jié)合觀察臀鰭的形狀準確區(qū)分。本課題組通過采樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，弓背青鳉棲息水域隨潮汐的漲落鹽度波動較大，其對鹽度波動的適應力強，有用于海水胚胎毒性分析的潛力。我國應用弓背青鳉胚胎進行毒性實驗及轉(zhuǎn)基因研究的工作基本鮮見報道，缺乏胚胎發(fā)育的基礎資料。筆者對弓背青鳉的發(fā)育過程進行連續(xù)觀察、記錄，以掌握胚胎各個時期的發(fā)育特點及胚胎發(fā)育過程中自發(fā)熒光的開始時期以及位置，為進一步研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

用手抄網(wǎng)采集廣東省廉江市高橋紅樹林區(qū)域的野生弓背青鳉，于實驗室馴養(yǎng)繁育，獲得F2代。養(yǎng)殖用水為海水晶配制的人工海水，鹽度為12，水溫控制在26 ℃；光暗周期比為14 h∶10 h；每日定時喂食鹵蟲幼體2次。

1.2 魚卵采集

實驗前1 d將1齡的F2代雌、雄親魚分開飼養(yǎng)，次日凌晨以雌雄比3∶2混養(yǎng)，約30 min后產(chǎn)卵受精。卵初排出時，卵與卵之間通過長絲相連，成簇地堆積在雌魚泄殖腔附近完成受精。在自然條件下，受精后數(shù)小時，卵黏附在水草上。為觀察完整的受精卵發(fā)育過程，受精完成后，取雌魚受精卵，去除卵間長絲。

1.3 胚胎發(fā)育觀察

取分離的受精卵，置于正置熒光顯微鏡下，連續(xù)觀察其發(fā)育過程。發(fā)育前期，每5 ～ 10 min觀察1次，發(fā)育至囊胚期后，每1 h觀察1次，器官形成期后每5 h觀察1次，對各時期典型的特征拍照記錄，參考Iwamatsu對日本青鳉胚胎發(fā)育時期的特征的描述[13]劃分弓背青鳉魚胚胎發(fā)育過程。分別在紅光熒光波長590 nm和綠光熒光波長515 nm觀察自發(fā)熒光現(xiàn)象，并記錄。

2 結(jié)果

2.1 胚胎發(fā)育過程

胚胎發(fā)育過程分為受精卵激活期、受精卵胚盤形成期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期及孵化出膜期共8個時期。根據(jù)各期形態(tài)特征的變化，把早期發(fā)育過程細分為 35個階段（圖1）。

未受精卵子呈乳白色，不透明，略扁平，卵膜較厚；未受精前，卵膜和卵黃間隙難辨；胚孔位于卵膜動物極，漏斗狀；卵黃占的比例較大；大小不一的油滴均勻嵌在卵黃表面，油滴大小有個體差異。

2.1.1 受精激活期 受精后2 ～ 3 min，肉眼觀察卵呈半透明狀，略帶黃色，有一定硬度，卵內(nèi)結(jié)構清晰可見，卵黃大而透明，位于卵中央。光鏡下可見嵌在原生質(zhì)皮層中的皮質(zhì)小泡開始破裂，位于動物極附近的皮質(zhì)小泡首先破裂，植物極附近的小泡最晚破裂，其內(nèi)容物進入卵膜與卵質(zhì)膜之間，使卵黃周圍空間變寬，卵膜與卵質(zhì)膜之間形成卵周隙。同時，卵膜變薄、變硬，卵黃之間的細胞質(zhì)開始向動物極流動，在動物極處產(chǎn)生一清晰的細胞質(zhì)區(qū)和一富含卵黃顆粒的植物區(qū)。

2.1.2 胚盤形成期 受精后45 min，卵子皮層的原生質(zhì)向動物極流動，逐漸凸起形成胚盤。在此期間，之前均勻分散于卵黃的油滴開始逐漸相互融合并向植物極遷移。隨著時間的推移，油滴開始進一步融合，形成十余個略大的油滴，至該發(fā)育階段結(jié)束時，動物半球的大部分油滴已遷移至植物半球，使植物極密度減小而朝上，動物極密度大而朝下。

2.1.3 卵裂期 2細胞期（受精后1 h 20 min）。胚盤逐漸向內(nèi)縊裂，第 1次卵裂為經(jīng)裂，卵裂溝穿過胚盤，將胚盤分裂成 2個大小相似近半球形的卵裂球。

4細胞期（受精后1 h 55 min）。經(jīng)向卵裂為4個大小相同的細胞。

8細胞期（受精后2 h 30 min）。第3次經(jīng)裂成8個細胞，每行4個細胞。

16細胞期（受精后3 h 15 min）。第4次仍為經(jīng)裂，分裂球排成4行，每行各4 個細胞，邊緣12個細胞較大，內(nèi)部4個細胞較小。

桑葚胚早期（受精后4 h 15 min）。細胞數(shù)約為64 ～ 128，外周細胞略小而扁平。

桑葚胚晚期（受精后5 h 30 min）。細胞變得更小，細胞數(shù)約256 ～ 512。

2.1.4 囊胚期 囊胚早期（受精后6 h 45 min）。約為1 000個細胞，細胞更小，形成半圓形的胚盤帽。

囊胚晚期（受精后8 h 20 min）。卵裂球已開始不同步分裂和遷移，導致胚盤帽變低，。

2.1.5 原腸胚期 早前期原腸胚（受精后 10 h）。胚盤帽變扁平，覆蓋在卵黃球上，細胞層開始下包。

原腸胚早期（受精后 13 h）。胚盤覆蓋卵黃約1/4，胚盤周邊的細胞內(nèi)卷形成胚環(huán)，將卵黃囊收緊；背部區(qū)域胚層細胞聚集形成胚盾。

原腸胚中期（受精后15 h 40 min）。胚盤覆蓋卵黃約 1/2，胚環(huán)清晰可見，胚盾面積增加，胚盾中間現(xiàn)一條淺的凹痕，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)原基——神經(jīng)嵴。

原腸胚晚期（受精后20 h 50 min）。胚盤覆蓋約3/4卵黃。

2.1.6 神經(jīng)胚期 早期神經(jīng)胚（受精后 23 h 40 min）。植物極僅剩少部分卵黃——卵黃栓未被細胞覆蓋；柱狀胚體形成，其中一段形成頭部。

晚期神經(jīng)胚（受精后 26 h）。胚體頭部兩側(cè)出現(xiàn)眼原基，胚孔未關閉前，尾部下方可見透明的Kupffer’s囊。

2.1.7 器官形成期 2肌節(jié)期（受精后28 h）。胚體現(xiàn)兩個明顯的肌節(jié)，眼泡后現(xiàn)耳囊原基突起。

4肌節(jié)期（受精后33 h）。前中后腦可辨3個區(qū)；中后腦兩側(cè)現(xiàn)體腔。

6肌節(jié)期（受精后38 h）。胚體中央現(xiàn)神經(jīng)褶；眼泡中可見晶狀體，體腔向后擴張。

9肌節(jié)期（受精后42 h）。卵黃囊上現(xiàn)少量黑色素細胞；心臟原基出現(xiàn)在腦下部，眼分化出不完全晶體。

12肌節(jié)期（受精后46 h）。眼睛內(nèi)可見完整的晶體輪廓，卵黃囊上現(xiàn)斑塊狀分布不一的黑色素斑塊，頭部現(xiàn)少量的棕紅色細胞——虹彩細胞。

16肌節(jié)期（受精后49 h）。心臟開始微弱跳動，居維氏管在頭部和胚體中部形成半循環(huán)，虹彩細胞開始擴散到胚體上。

19肌節(jié)期(受精后58 h)。心臟的跳動達到70-80次/分，主動脈可見血液流動，Kupffer’s囊完全消失。

24肌節(jié)期（受精后68 h）。胚體環(huán)繞5/8的卵黃囊，黑色素細胞開始在眼泡中沉積而變暗；尾部開始和卵黃分離。

30肌節(jié)期（受精后74 h）。胚體尾部約1/3完全脫離卵黃囊，虹彩細胞擴散到軀干上，黑色素細胞在頭部和軀干形成斑狀。

35肌節(jié)期（發(fā)眼期）（受精后97 h）。胚體環(huán)繞卵黃囊5/6，眼泡變黑，但晶體透明；耳囊內(nèi)現(xiàn)2大透明膜突起，該時期也稱為發(fā)眼期。

鰓血管形成期（受精后112 h）。眼泡可以看到黑色的脈絡；血液可以在鰓弓中循環(huán)，心跳達90 ～110次/min，軀干出現(xiàn)不規(guī)律抖動。

肌節(jié)完成期（受精后124 h）。尾部完全脫離卵黃，胚體后部也有部分脫離卵黃囊，并不規(guī)律擺動。

脊索空泡化完成期（受精后132 h）。脊索已完全空泡化；眼泡完全黑化，強光下方可辨認晶體。

胸鰭血液循環(huán)期（受精后149 h）。胚體完全環(huán)繞卵黃囊，眼泡完全黑化；胸鰭經(jīng)常擺動，出現(xiàn)血液循環(huán)；尾鰭現(xiàn)幾個黑色素團；尾尖到達眼部。

內(nèi)臟血管形成期（受精后159 h）。胚體下頜形成，口腔在口凹處開放；血液循環(huán)通過內(nèi)臟，軀體血液可見；尾尖伸展越過眼泡，虹彩細胞從頭部到尾端以分散方式分布，頭腹部區(qū)域現(xiàn)黃色素細胞團，主要為黃色。

心臟發(fā)育期（受精后170 h）。尾尖到達耳囊；心臟現(xiàn)明顯的心房和心室。

心包腔形成期（受精后8 d）。心臟發(fā)育完全，環(huán)繞心臟的心包腔突出；尾尖超過耳囊；腸道有一狹窄的內(nèi)腔。

脾發(fā)育期（受精后9 d）。下頜和眼睛活動明顯。

圖1 弓背青鳉胚胎發(fā)育Fig.1 Embryonic Development of Oryzias curvinotus

2.1.8 孵化出膜期 孵化期（受精后10 d 20 h ～ 12 d）。尾鰭已達胸鰭后，胚體在卵膜內(nèi)偶有翻轉(zhuǎn)；卵黃越來越小，卵膜變薄，胚體幾乎貼在卵膜上，該時期胚體已至出膜期。

仔魚出膜時，尾部抖動，破卵膜而出，軀體伸展開始后，再完全甩掉卵膜。剛出膜仔魚體長約3 ～4 mm，軀體有少量色素斑；卵黃囊橢圓形。

2.2 自發(fā)熒光

自發(fā)熒光主要是色素細胞內(nèi)物質(zhì)在激發(fā)光下產(chǎn)生的，所以自發(fā)熒光位置與色素細胞的出現(xiàn)和分布密切相關，發(fā)育至9肌節(jié)期時，胚體和卵黃上均出現(xiàn)黑色色素團，塊狀，位置無規(guī)律，于藍色和綠色激發(fā)光下并未自發(fā)熒光（圖2-1,2,3）。在12肌節(jié)期時，頭部先出現(xiàn)少量紅棕色細胞，此時在熒光激發(fā)出現(xiàn)自發(fā)熒光，亮度較暗；在 16肌節(jié)期時，紅棕色細胞團往身體部位遷移，呈樹突狀和梭狀，此時自發(fā)熒光較強，發(fā)光位置與紅棕色細胞團一致（圖2-4,5,6）；在35肌節(jié)期時，已開始遷移至尾部，熒光出現(xiàn)位置仍與紅棕色細胞團一致，但在身體上分布位置隨機（圖2-7,8,9）；在孵化期，熒光分布于頭部及脊索對應的體節(jié)上，呈點狀（圖2-10,11,12）；出膜后，其位置基本與孵化期一致（圖2-13,14,15）。

圖2 弓背青鳉胚胎發(fā)育過程中的自發(fā)熒光Fig.2 Spontaneous fluorescence during the development of Oryzias curvinotus embryonic

3 討論

3.1 受精卵油球

魚類油球成分主要是脂肪, 密度比水小，因此有油球的卵子一般是浮性卵[14]。然而，弓背青鳉的受精卵與海水青鳉[15]、中華青鳉[16]、日本青鳉[17]等其他青鳉屬魚類一樣為多油球沉性卵，其油球隨機地鑲嵌于卵周細胞質(zhì)中，受精成功后, 油球逐漸融合。大瀧六線魚（Hexagrammos otakii）[18]、黃姑魚（Nibea albiflora）[19]、黃斑籃子魚（Siganus oramin）[20]、棘頰雀鯛（Premnas biaculeatus）[21]和半滑舌蹋（Cynoglossus semilaevis）[22]等硬骨魚類受精卵的油球融合發(fā)生在特定時期。王友紅等[15]提出，在多油球的魚類受精卵中，油球融合時期可作為發(fā)育時期的一重要特征。而弓背青鳉卵裂結(jié)束后形成數(shù)個聚于植物極的大油球的融合及數(shù)量變化并無明顯規(guī)律：有的在神經(jīng)胚期便融合為一個大油球，有的在器官形成期油球尚未融合，因此，根據(jù)油球特征對發(fā)育分期并不適用于弓背青鳉。

3.2 Kupffer’s囊

Kupffer’s囊是一個內(nèi)含單纖毛細胞(Monociliated cells) 的器官[23]。近年來研究證實，斑馬魚（Danio rerio）單纖毛細胞在Kupffer’s囊背腹部的不對稱分布會使內(nèi)液逆時針流動，導致胚胎發(fā)育的不對稱性，從而啟動斑馬魚不對稱發(fā)育[24]，例如胃、心臟和脾臟就是典型的不對稱發(fā)育器官。然而，越來越多研究發(fā)現(xiàn)，并非所有硬骨魚類均有Kupffer's囊，大鱗鲃（Barbus capito）[25]、普安銀鯽（Carassius auratus）[26]、大瀧六線魚[18]等則無Kupffer’s囊，而在黃海大頭鱈（Gadus macrocephalus）的胚胎發(fā)育中僅 10%個體出現(xiàn)Kupffer’s囊[27]。本研究中，弓背青鳉所有胚體尾部均有Kupffer’s囊，且僅見于尾部位置；其出現(xiàn)于晚期神經(jīng)胚階段，即胚孔關閉前。隨胚胎的發(fā)育，弓背青鳉的Kupffer’s囊會逐漸變大，但位置并不會改變；當發(fā)育至尾部將游離的 19體節(jié)期，Kupffer’s囊已逐漸消失，而此時器官尚未形成。海水青鳉Kupffer’s囊出現(xiàn)于胚孔關閉前，消失于器官形成的心臟跳動期[13]。因此，Kupffer’s囊對于青鳉不同物種不對稱性發(fā)育的作用是否存在明顯分化還有待進一步研究。

3.3 自發(fā)熒光原因

硬骨魚類色素細胞起源于神經(jīng)脊細胞[28]，主要包括黑色素細胞、黃色素細胞、紅色素細胞、虹彩細胞[29-30]。色素細胞呈色方式有2種：一是細胞內(nèi)含有色素，細胞所呈現(xiàn)的顏色是其所含色素的顏色；二是通過反射特定波長光的方式呈色[31]。從觀察結(jié)果來看，在只出現(xiàn)黑色素細胞時無自發(fā)熒光，至發(fā)育后期黑色素細胞位置亦無自發(fā)熒光；黃色素細胞出現(xiàn)的時間與自發(fā)熒光出現(xiàn)時間不一致；虹彩細胞出現(xiàn)時，自發(fā)熒光開始出現(xiàn)，且位置一致。可見自發(fā)熒光主要來自于虹彩細胞。研究表明，虹彩細胞的呈色物質(zhì)主要是與水結(jié)合成晶體形式的嘌呤類物質(zhì)，通過反射特定波長的光表現(xiàn)為白色、藍色和紫紅 3 種色彩結(jié)晶體[32]。在曼龍魚（Trichogaster trichopterus）中，虹彩細胞排列緊密，呈白色或銀白色，僅分布在鱗片表層[33]。橘色雙冠麗魚（Amphilophus citrinellus）虹彩色素細胞形狀不規(guī)則，與其他色素一起表現(xiàn)出不同的顏色[34]。本研究中，觀察到的虹彩細胞為棕紅色，點狀分布于脊索上方，起吸收紫外光[35]、保護神經(jīng)索的作用。