吳 蓓，張木清，鄭巖松，戴修純

（廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510335）

【研究意義】大頂苦瓜（Momordica charantiaLinn.）為葫蘆科苦瓜屬1年生草本蔓生蔬菜，是廣東省的著名蔬菜品種，具有個(gè)大、肉厚、皮色翠綠、口感脆嫩的特點(diǎn)，并具較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用功效［1］，長(zhǎng)期以來暢銷我國(guó)華南地區(qū)并遠(yuǎn)銷東南亞國(guó)家。隨著大頂苦瓜被越來越多的消費(fèi)者接受，其種植面積日益加大，但存在嚴(yán)重的重茬連作問題引發(fā)各種蔬菜疫病如苦瓜枯萎病等土傳病害的暴發(fā)。傳統(tǒng)的苦瓜嫁接栽培技術(shù)利用砧木良好的抗病性等特點(diǎn)，已大大降低了苦瓜栽培時(shí)的死亡率，但依舊存在生產(chǎn)成本過高、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、費(fèi)用高等缺點(diǎn)。微嫁接是一種由組織培養(yǎng)的接穗與砧木進(jìn)行嫁接的技術(shù)，它是植物組織培養(yǎng)與嫁接技術(shù)的結(jié)合［2］。微嫁接已被廣泛應(yīng)用于植物病毒快速檢測(cè)［3-4］、珍貴育種材料繁殖保存、植物病毒脫除［5］、接口部位生理與組織結(jié)構(gòu)研究以及工廠化苗木快繁等方面［6］。微嫁接通常分試管內(nèi)嫁接和試管外嫁接兩種［7］：試管內(nèi)微嫁接技術(shù)開發(fā)于1972年［8］，該技術(shù)中不同品種的砧木與接穗均為組培苗，在組織培養(yǎng)條件下進(jìn)行嫁接；試管外微嫁接技術(shù)是將無毒的組培苗作為接穗、種子萌發(fā)而成的健壯種苗作為砧木，在自然環(huán)境中進(jìn)行嫁接。與常規(guī)的嫁接方法相比，試管外微嫁接具有其自身特有的優(yōu)越性［9］，如作為組培苗來源的接穗生長(zhǎng)周期短、費(fèi)用低、占地少；接穗不受季節(jié)限制和環(huán)境影響，可隨時(shí)從實(shí)驗(yàn)室取材；種子發(fā)育而來的砧木可為接穗提供充足的營(yíng)養(yǎng)來源，抵抗病害，促進(jìn)接穗快速生長(zhǎng)。【前人研究進(jìn)展】雖然微嫁接技術(shù)已應(yīng)用于棗［10］、柑橘［11］、蘋果、葡萄、桃、沙田柚和龍眼等多種果樹［1］，以及金焰彩欒［12］、麻瘋樹［13］等木本植物的研究和生產(chǎn)中，但由于蔬菜組培苗的組織幼嫩、操作技術(shù)要求高、培養(yǎng)條件嚴(yán)格，目前為止尚無在苦瓜乃至蔬菜類種植中應(yīng)用的報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前期相關(guān)研究已表明，在相同的栽培條件下，苦瓜組培苗長(zhǎng)勢(shì)普遍較對(duì)應(yīng)的種子苗弱，但是其葉色、分枝性、果實(shí)形態(tài)特征、單瓜重量和單株產(chǎn)量與種子苗無明顯差異，且具有提早成熟、整齊度高等優(yōu)點(diǎn)［14］?！緮M解決關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)對(duì)大頂苦瓜組培苗在試管外微嫁接技術(shù)進(jìn)行了研究，以期提高大頂苦瓜組培苗的栽培水平，為今后蔬菜類試管外微嫁接技術(shù)在工廠化育苗的推廣及應(yīng)用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試接穗材料為2017年3月在廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院南沙展示基地種植的頂培1號(hào)苦瓜，是該研究院選育的雜交品種單株組培擴(kuò)繁苗；砧木選擇絲瓜銀砧1號(hào)、絲瓜銀砧2號(hào)和南瓜海砧1號(hào)，購(gòu)自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接穗的獲得 取頂培1號(hào)苦瓜萌發(fā)的頂芽或側(cè)芽為外植體，經(jīng)消毒滅菌后逐步接種在誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)基上，外植體的具體培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)［14］進(jìn)行。培養(yǎng)約20 d后，將生長(zhǎng)健壯、莖干直徑達(dá)0.2～0.25 cm、高5～7 cm的組培苗進(jìn)行強(qiáng)光煉苗4～9 d，再剪成帶2個(gè)芽的莖段作為接穗，將接穗下部削成楔形，然后將其置于在一定濃度（0、0.3、0.5、0.7 mol/L）的6-BA中浸蘸5 s，備用。

1.2.2 砧木的培養(yǎng) 南瓜或絲瓜的種子先經(jīng)過50～60℃溫水浸種和31～33℃催芽處理，待種子芽露白后，播種于已澆足澆透水的營(yíng)養(yǎng)缽中，再蓋上一層經(jīng)多菌靈（稀釋200倍）滅菌的細(xì)沙土。種子播種后仍保持基質(zhì)濕潤(rùn)，將約7 d后發(fā)芽并長(zhǎng)出一定數(shù)量真葉的植株作為砧木。

1.2.3 嫁接方法 由于蔬菜組織較為細(xì)嫩，本研究采用劈接法。待南瓜或絲瓜長(zhǎng)出真葉后，剪去真葉和中心生長(zhǎng)點(diǎn)，只留兩片子葉，且從兩片子葉中間劈開，將底部削成楔形的接穗插入砧木切口，用橡皮套管+嫁接夾、封口膜、保鮮膜纏繞等不同保濕材料進(jìn)行保濕和固定處理，7 d后去除綁接材料。

1.2.4 嫁接后培養(yǎng) 嫁接后，將嫁接苗置于溫室內(nèi)的全封閉小拱棚內(nèi)，溫度保持在25～30℃，每天對(duì)嫁接部位噴灑一定濃度（0%、3%、6%、9%）的蔗糖溶液。前4 d拱棚內(nèi)保持在一定的高濕度（85%、90%、95%、100%）條件，用黑紗全遮光處理；從第5天開始逐漸通風(fēng)，降低棚內(nèi)濕度至80%～85%，逐漸增加光照直至接穗發(fā)芽并長(zhǎng)出2片新葉，撤去遮光黑紗；1周后及時(shí)剪去砧木發(fā)出的萌蘗；約20 d后獲得嫁接苗的杯苗，再移栽到大田種植。

1.2.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 每組試驗(yàn)取25～30株外植體，3次重復(fù)，取平均值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和鄧肯多重比較。

芽長(zhǎng)增加量（cm）=成活嫁接苗接穗長(zhǎng)度-嫁接當(dāng)天接穗長(zhǎng)度

株高增加量（cm）=成活嫁接苗總株高-嫁接當(dāng)天總株高

2 結(jié)果與分析

2.1 嫁接口的固定保濕條件對(duì)大頂苦瓜嫁接苗成活率的影響

與試管內(nèi)微嫁接能保持恒溫恒濕條件不同，本試驗(yàn)的嫁接操作均在普通大氣環(huán)境中進(jìn)行，因此嫁接口的保濕對(duì)接口的愈合起著至關(guān)重要的作用。但組培芽組織相對(duì)于取自種子苗的芽又非常細(xì)小幼嫩，稍有不慎就容易干枯，因此對(duì)嫁接部位固定和保濕條件的選擇需非常謹(jǐn)慎。本試驗(yàn)主要采取橡皮套管+嫁接夾、封口膜和保鮮膜等3種方式對(duì)嫁接傷口進(jìn)行固定、愈合和保濕處理。由于蔬菜作為嫁接材料比較細(xì)小，用封口膜和保鮮膜纏繞嫁接口的操作比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且在操作過程中易使接穗脫落，在這兩種方式下嫁接成活率僅為12%～14%。而嫁接夾操作要比用封口膜和保鮮膜纏繞簡(jiǎn)捷，配上橡皮套管會(huì)顯著提高保濕效果，成活率達(dá)到62.7%。約7 d后可取下嫁接夾（圖1），統(tǒng)計(jì)嫁接成活率。

嫁接后前4 d，小拱棚中濕度的保持對(duì)大頂苦瓜嫁接苗的成活率也有很大影響。隨著濕度的增加，大頂苦瓜嫁接苗成活率也逐步提高，但濕度太高也容易造成霉菌滋生，從而導(dǎo)致嫁接苗腐爛。當(dāng)濕度為85%、90%時(shí)，嫁接成活率分別為40.9%和52.3%；當(dāng)濕度保持在95%時(shí)，嫁接成活率最高、達(dá)到60%以上；但當(dāng)濕度繼續(xù)升高為100%時(shí)，由于大部分苗腐爛，嫁接成活率反而低于40%。

圖1 大頂苦瓜嫁接苗采用嫁接夾（左）及嫁接7 d后長(zhǎng)勢(shì)（右）Fig. 1 The broad-shoulder bitter gourd micrografted with grafting clip (left) and the growth vigor after 7 days (right)

2.2 接穗煉苗時(shí)間對(duì)大頂苦瓜嫁接苗成活率和接穗長(zhǎng)度增加量的影響

由于作為接穗的頂培1號(hào)組培苗不定芽長(zhǎng)期生長(zhǎng)在恒溫恒濕、恒定光照并且完全無菌的環(huán)境中，將其移栽至自然條件下需要經(jīng)過一段適宜的煉苗環(huán)節(jié)。不同的煉苗時(shí)間對(duì)嫁接成活率以及嫁接后接穗長(zhǎng)度的增加量都有一定影響。由表1可知，煉苗時(shí)間低于5 d時(shí)，嫁接成活率較低，接穗增長(zhǎng)不明顯；煉苗時(shí)間6～7 d，嫁接成活率超過60%，接穗增加量與其他時(shí)期有明顯差異；隨著煉苗時(shí)間的延長(zhǎng)，接穗增加量稍有增加，但嫁接成活率又逐漸下降，9 d后下降到不足40%。因此，苦瓜組培苗最適宜的煉苗時(shí)間為6～7 d。

表1 接穗煉苗時(shí)間對(duì)大頂苦瓜嫁接苗成活率和接穗長(zhǎng)度增加量的影響Table 1 Effect of different hardening time on the survival rate and increment in scion length of the micrografted seedlings

2.3 砧木種類和苗齡對(duì)大頂苦瓜嫁接苗成活率和株高增加量的影響

不同種類的砧木以及砧木的木質(zhì)化程度會(huì)直接影響嫁接成活率。本試驗(yàn)分別以絲瓜銀砧1號(hào)、絲瓜銀砧2號(hào)和南瓜海砧1號(hào)作為砧木，研究當(dāng)2片真葉長(zhǎng)度0、0.5、1.0、1.5 cm時(shí)，嫁接15 d后對(duì)大頂苦瓜嫁接苗成活率以及株高增加量的影響。從表2可以看出，當(dāng)絲瓜銀砧1號(hào)的2片真葉長(zhǎng)度達(dá)0.5 cm時(shí)，大頂苦瓜嫁接苗的成活率和株高增加量均較高；南瓜海砧1號(hào)真葉0.5 cm時(shí)，大頂苦瓜嫁接苗的株高增加量最大，但是嫁接成活率明顯低于銀砧1號(hào)，因此首選帶有2片約0.5 cm真葉苗齡的銀砧1號(hào)作為砧木進(jìn)行微嫁接。

表2 砧木種類和苗齡對(duì)大頂苦瓜嫁接苗成活率和株高增加量的影響Table 2 Effect of species and ages of rootstocks on the survival rate and increment in height of the micrografted seedlings

2.4 6-BA濃度和蔗糖濃度對(duì)大頂苦瓜嫁接苗生長(zhǎng)的影響

2.4.1 6-BA濃度 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑特別是生長(zhǎng)素在嫁接過程中起著至關(guān)重要的作用，能減輕氧化作用，促進(jìn)形成層活動(dòng)，產(chǎn)生大量愈傷組織，形成維管束系統(tǒng)，從而促使嫁接口相互愈合，提高嫁接苗的成活率以及株高增加量。因此，本試驗(yàn)將接穗末端置于含有0、0.3、0.5、0.7 mol/L 6-BA溶液中浸蘸3 s，結(jié)果（表3）表明，在接穗末端接口部位浸蘸6-BA后，確實(shí)能夠明顯提高嫁接成活率，并且隨著6-BA濃度的增加，接穗嫁接成活率也相應(yīng)提高，當(dāng)6-BA濃度為0.5 mol/L時(shí)成活率最高、達(dá)65.3%；浸蘸6-BA對(duì)嫁接苗的株高增長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，但與不浸蘸6-BA相比沒有顯著差異。

表3 6-BA濃度對(duì)大頂苦瓜嫁接苗生長(zhǎng)的影響Table 3 Effect of different concentrations of 6-BA on the growth of the micrografted seedlings

2.4.2 蔗糖濃度 有研究認(rèn)為，蔗糖對(duì)果樹類植物微嫁接植株的葉片大小、總?cè)~片數(shù)、葉片生長(zhǎng)量及新根比例等都有一定的促進(jìn)作用［16］，因此本試驗(yàn)在嫁接操作后采用對(duì)嫁接口噴灑一定濃度蔗糖水的方式提高嫁接成活率。從表4可以看出，與噴灑清水相比，對(duì)嫁接口噴灑蔗糖水能明顯提高嫁接成活率，嫁接成活率都在50%以上，其中當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%時(shí)，嫁接成活率最高達(dá)65.9%。但噴灑蔗糖與否對(duì)株高增加量沒有顯著促進(jìn)作用。

表4 蔗糖濃度對(duì)大頂苦瓜嫁接苗生長(zhǎng)的影響Table 4 Effect of different concentrations of sucrose on the growth of the micrografted seedlings

2.5 大頂苦瓜微嫁接苗的大田移植和栽培

本試驗(yàn)采用的接穗組培苗試管外微嫁接技術(shù)可以直接獲得微嫁接杯苗，嫁接成活后的大頂苦瓜杯苗培養(yǎng)28 d左右可以長(zhǎng)到30～35 cm，直接移到大田栽培后成活率可達(dá)60%以上（圖2）。

圖2 大頂苦瓜微嫁接杯苗培養(yǎng)28 d（左）及2個(gè)月（右）長(zhǎng)勢(shì)Fig. 2 The growth vigor of micrografted cup seedlings of the broad-shoulder bitter gourd cultured after 28 days (left) and 2 months (right)

3 討論

棗類試管外嫁接結(jié)果表明，微嫁接口的固定以及保濕方法是影響組培苗試管外嫁接成活率高低的首要關(guān)鍵因素［10］。在本試驗(yàn)中，接穗為蔬菜作物的組培苗，相對(duì)于果樹而言更加幼嫩、個(gè)體更小，因此，選擇保濕效果好、操作簡(jiǎn)便的保濕材料尤為重要。本試驗(yàn)嫁接口選用橡皮套管+嫁接夾的方式，既有良好的保濕作用，又簡(jiǎn)便易行，顯著提高了嫁接成活率；并且在后續(xù)試驗(yàn)中，用過的橡皮套管和嫁接夾經(jīng)過消毒后還能繼續(xù)使用，降低了生產(chǎn)成本。

影響組培苗試管外嫁接成活率高低的第二個(gè)關(guān)鍵因素是接穗質(zhì)量。接穗應(yīng)盡量挑選健壯的芽，嫁接前用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（如6-BA）浸蘸削好的楔形底部，更有利于接穗生長(zhǎng)；其次應(yīng)進(jìn)行強(qiáng)光煉苗，因?yàn)閺?qiáng)光煉苗可以誘導(dǎo)幼嫩的組培苗莖葉保護(hù)組織的形成和恢復(fù)氣孔調(diào)節(jié)功能，使其對(duì)水分脅迫和環(huán)境因子的抗性明顯增強(qiáng)，這與及華等［15］研究結(jié)果一致。煉苗時(shí)間短于5 d，接穗組培苗木質(zhì)化程度不足，嫁接時(shí)容易干枯，隨著煉苗時(shí)間延長(zhǎng)至8 d后，組培苗莖桿的木質(zhì)化程度提高，與砧木的傷口不易愈合，嫁接苗的成活率逐漸下降，接穗增長(zhǎng)量雖然有所增加卻未達(dá)到顯著差異，這與成密紅等［17］、王國(guó)平等［18］研究結(jié)果一致。

以往研究均表明，砧木的種類和苗齡對(duì)嫁接苗成活與否常起著關(guān)鍵作用。在本試驗(yàn)中，砧木第1次出現(xiàn)兩片真葉且長(zhǎng)度達(dá)到0.5 cm時(shí)，嫁接效果最佳，隨著砧木苗齡增加，嫁接效果變差，且以絲瓜作為砧木的微嫁接成活率高于南瓜為砧木。這可能是由于砧木苗齡越大，維管組織成熟度越高，愈傷形成能力下降，接穗無法及時(shí)從砧木獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而干枯死亡所致。與南瓜相比，絲瓜與苦瓜更易親和。

組培苗嫁接后的管理也是嫁接成敗的關(guān)鍵，除了嫁接口的保濕外，周圍環(huán)境的濕度也很重要。以往研究表明，濕度通常應(yīng)該前期高后期低，之后濕度逐漸降低至與周圍環(huán)境濕度一致。嫁接苗前期遮蔭也有利于嫁接口的傷口愈合。我們經(jīng)過多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)環(huán)境濕度達(dá)到100%時(shí)，霉菌滋生嚴(yán)重，造成嫁接苗大多腐爛、成活率較低；而環(huán)境濕度過低，接穗容易失水枯萎。有研究表明，一定濃度的蔗糖水對(duì)嫁接苗的成活和生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，本研究在嫁接后嘗試采用噴灑一定濃度蔗糖水的方法，嫁接成活率確有提高，但是嫁接苗株高增長(zhǎng)量沒有提高，這可能是蔗糖作為碳源促進(jìn)了組培苗接穗的成活。

本試驗(yàn)采用的組培苗試管外微嫁接技術(shù)，可以直接獲得微嫁接杯苗，中間減少了組培苗生根及煉苗后移栽等環(huán)節(jié)，嫁接成活后的杯苗培養(yǎng)28 d左右可以長(zhǎng)到30～35 cm，直接移到大田栽培成活率可達(dá)60%以上。這種微嫁接營(yíng)養(yǎng)杯苗可周年生產(chǎn)，不受季節(jié)限制，且1株5～7 cm高的組培苗可以獲得2～3個(gè)接穗，降低了生產(chǎn)成本。苦瓜組培苗試管外微嫁接技術(shù)的應(yīng)用，將有利于提高苦瓜組培苗的栽培成活率、縮短苦瓜的育種年限，并為其他蔬菜類作物試管外微嫁接技術(shù)的開發(fā)提供借鑒。

4 結(jié)論

首次建立了大頂苦瓜組培苗試管外微嫁接技術(shù)體系。在該體系中，大頂苦瓜組培苗接穗最適宜的煉苗時(shí)間為6～7 d；嫁接口的固定和保濕對(duì)嫁接成活與否很重要，采用橡皮套管加嫁接夾包裹嫁接口操作容易，保濕效果顯著；選擇帶兩片真葉的絲瓜銀砧1號(hào)作為砧木嫁接成活率高；嫁接前，接穗末端浸蘸0.5 mol/L 6-BA，并且在嫁接后每天噴灑6%蔗糖溶液可以大大提高嫁接苗的成活率，獲得最高嫁接成活率是65.9%。該技術(shù)的應(yīng)用將改善在相同栽培條件下，苦瓜組培苗長(zhǎng)勢(shì)比實(shí)生苗弱的特點(diǎn)，提高苦瓜組培苗的成活率。