劉 磊，盧冰霞，陳忠偉，秦毅斌，段群棚，周英寧，何 穎，李 斌，梁家幸，閉炳芬，蔣冬福，盧敬專，楊思儀，蘇乾蓮，趙 武

（廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001）

2015年6月，美國北卡羅來納州一規(guī)?；i場暴發(fā)PDNS（豬皮炎腎病綜合征）疫情。Palinski等[1]借助新一代測序（NGS）技術(shù)，從發(fā)病母豬及流產(chǎn)胎兒體內(nèi)首次鑒定出PCV3。隨后包括美國、韓國、意大利、巴西以及中國的華南、華中和華北多省市都有PCV3流行的報道。PCV3感染可引起豬的皮炎腎病綜合征、種豬繁殖障礙及包括心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等多系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，給全世界的生豬養(yǎng)殖造成了很大的經(jīng)濟損失。作為一種新動物病原體，PCV3對豬的致病性、其在圓環(huán)病毒相關(guān)疾病中的作用以及其與其他病原的混合感染及互相作用機制還有待進一步研究。

2018年11月28日，廣西一存欄1 000頭母豬場突然出現(xiàn)懷孕后期母豬流產(chǎn)，每天2～5頭母豬流產(chǎn)。母豬流產(chǎn)前不食，體溫正常，流產(chǎn)后很快恢復(fù)采食。12月3日豬場將其中2窩流產(chǎn)胎兒送往廣西獸醫(yī)研究所病毒研究室進行檢測，剖檢發(fā)現(xiàn)胎兒腦充血、肺臟充血出血、腎臟有針尖大的出血點、全身多處淋巴結(jié)腫大。實驗室檢測結(jié)果表明，PCV3感染可能是引起本次母豬流產(chǎn)的主要原因?，F(xiàn)將該病例的檢測報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料

流產(chǎn)胎兒2窩，每窩3頭，共6頭，由廣西某豬場送往本實驗室進行病原檢測。

1.2 主要試劑

病毒基因組DNA/RNA快速抽提試劑盒為Axygen生物科技有限公司產(chǎn)品；2xF8 Fastlong PCR MasterMix為北京艾德萊生物科技公司產(chǎn)品；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）為北京陸橋公司產(chǎn)品；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒為康為世紀公司產(chǎn)品；DL 2 000 DNA Marker為Takala公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計與合成

參考文獻[2]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成PCV3檢測引物，PCR擴增核苷酸預(yù)期為649 bp。引物序列：P1：5'-TTTTCACTTAGAGAACGGACTTG-3'；P2：5'-AAATGAGACACAGAGCTATATTCAG-3'。

1.4 細菌分離

用無菌接種環(huán)采取流產(chǎn)胎兒腦、腎臟、脾臟和肺臟接種到TSA平板培養(yǎng)基上，放在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，看是否有細菌生長。

1.5 病毒檢測

1.5.1 病料處理 每窩流產(chǎn)胎兒（3頭）混為一份進行處理，無菌條件下采取流產(chǎn)胎兒的腦、肝臟、肺臟和脾臟等部位按照1∶3添加滅菌的PBS溶液，用勻漿器進行研磨；懸液反復(fù)凍融3次；12 000 r/min離心5 min，取上清液用于下一步DNA/RNA的提取。

1.5.2 DNA/RNA的提取 處理好的組織病料按照AxyPrep Body Fluid Viral RNA/DNA Miniprep Kit使用說明書進行DNA/RNA提取，所獲得的DNA用于下一步的PCR反應(yīng)或置于-80℃保存，備用；所獲得的RNA用于下一步的RT-PCR，或置于-80℃保存，備用。

1.5.3 PCR/RT-PCR檢測 通過PCR/RT-PCR的方法檢測流產(chǎn)胎兒腦及內(nèi)臟組織樣品中是否有CSFV（豬瘟病毒）、PRRSV（豬藍耳病病毒）、JEV（豬乙腦病毒）、PRV（豬偽狂犬病病毒）、PPV（豬細小病毒）、PCV2（圓環(huán)病毒2型）和PCV3等這些可能引起母豬流產(chǎn)的病毒存在。參考羅廷榮等[3]建立的CSFV RT-PCR檢測方法對組織樣品進行檢測，目的片段大小為478 bp；參考韋瑩等[4]建立的PRRSV RT-PCR檢測方法對組織樣品進行檢測，目的片段大小為443 bp；參考李茂寧等[5]建立的JEV RT-PCR檢測方法對組織樣品進行檢測，目的片段大小為228 bp；參考周復(fù)春[6]建立的PRV PCR檢測方法對組織樣品進行檢測，目的片段大小為217 bp；參考于新友等[7]建立的PPV PCR檢測方法對組織樣品進行檢測，目的片段大小為475 bp；參考李瑩瑩[8]建立的PCV2 PCR檢測方法對組織樣品進行檢測，目的片段大小為1 154 bp；參考賀會利等[2]建立的PCV3對樣品進行檢測，目的片段大小為649 bp。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離結(jié)果

在TSA培養(yǎng)基上未有任何菌落生長。

2.2 組織樣品PCR/RT-PCR檢測結(jié)果

組織樣品PCR/RT-PCR檢測結(jié)果顯示，送檢的2窩流產(chǎn)胎兒 CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PPV、PCV2 均為陰性，而PCV3均為陽性，結(jié)果見圖1、圖2。將該PCV3陽性PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結(jié)果在NCBI里進行Blast，結(jié)果顯示測序所得核苷酸序列與NCBI上登錄的其他PCV3同源性在97.8%～99.7%之間，表明該流產(chǎn)胎兒感染PCV3。

圖1 流產(chǎn)胎兒組織樣品PCR/RT-PCR檢測結(jié)果

圖2 流產(chǎn)胎兒組織樣品PCR/RT-PCR檢測結(jié)果

3 分析與小結(jié)

在養(yǎng)豬生產(chǎn)中能夠引起妊娠母豬流產(chǎn)的原因有很多，營養(yǎng)原因、機械損傷原因、應(yīng)激原因、疾病原因以及不合理的用藥等都可能造成妊娠母豬流產(chǎn)。2018年11月底廣西某豬場連續(xù)數(shù)日出現(xiàn)多頭妊娠后期母豬流產(chǎn)現(xiàn)象。養(yǎng)豬場在出現(xiàn)流產(chǎn)前的1周內(nèi)懷孕母豬未進行過疫苗免疫和群體用藥，母豬群也未表現(xiàn)出外陰紅腫、脫肛等霉菌毒素中毒的現(xiàn)象，豬群在出現(xiàn)流產(chǎn)前也未受到大的應(yīng)激。在排除霉菌毒素中毒、用藥不當和管理不當造成的應(yīng)激等可能的原因后，懷疑是疾病因素造成的妊娠母豬流產(chǎn)。2018年12月3日豬場將流產(chǎn)胎兒送本實驗室進行病原檢測。

隨著PCV3在國內(nèi)外不同地區(qū)流行的報道，其致病性也越來越受到更多學(xué)者的關(guān)注。2017年6月Faccini等[9]收集了意大利不同地區(qū)豬群中共計16份流產(chǎn)胎兒或死胎組織，流產(chǎn)胎兒和死胎的腦、淋巴、心臟等組織內(nèi)均檢測出PCV3，病毒滴度為 1×109～1×1010copies/g，而其他相關(guān)病原體檢測結(jié)果均為陰性，表明PCV3可能與繁殖障礙相關(guān)。同年8月，Tochetto等[10]從巴西一農(nóng)場出現(xiàn)繁殖障礙的母豬血清內(nèi)檢測到了PCV3并進行了全基因的擴增，而從同一農(nóng)場正常生產(chǎn)的母豬血清中未檢測到PCV3，結(jié)果也提示PCV3可能與該農(nóng)場的母豬繁殖障礙有關(guān)。為了解引起廣西某規(guī)?；i場母豬流產(chǎn)的病因，本實驗室采用細菌分離培養(yǎng)方法進行細菌分離鑒定；采用PCR/RT-PCR方法檢測可能與母豬流產(chǎn)相關(guān)的病毒如CSFV、PRRSV、JEV、PRV、PPV、PCV2和 PCV3。結(jié)果在流產(chǎn)胎兒內(nèi)臟組織中未分離到細菌；2份流產(chǎn)胎兒的內(nèi)臟組織中都檢測到PCV3，而其他病原均為陰性，提示PCV3感染可能是引起本次母豬流產(chǎn)的主要原因，提示PCV3也是導(dǎo)致母豬流產(chǎn)的重要病原，應(yīng)引起業(yè)界的警惕重視，并加以防范這一新發(fā)疫病。