郭永智，魏 茜，高 潔，劉冰語，張 濤，華會明，胡友財*

1沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，沈陽 110016；2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所 天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，北京 100050

嗜低溫真菌(psychrophilic fungi)分布于地球的兩極地區(qū)、高山多年凍土、冰川、海洋深處等生態(tài)系統(tǒng)中，它們長期面臨低溫、強紫外輻照、頻繁的凍融循環(huán)、營養(yǎng)物質(zhì)匱乏、高壓等其中一種或多種極端條件的考驗[1]。為了適應(yīng)極端的生存環(huán)境，這些真菌形成了特殊的生理代謝特征和化學(xué)防御機制，包括冷適應(yīng)酶的存在、酶活性和代謝速率的改變、胞外多糖及特殊次級代謝產(chǎn)物的生成等[1-4]。近年來，關(guān)于極端環(huán)境真菌次生代謝產(chǎn)物的研究愈發(fā)引起人們的關(guān)注，越來越多的具有獨特結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物被從低溫真菌中分離得到，許多化合物表現(xiàn)出顯著的細胞毒、抗菌、抗病毒和抗氧化等活性[5-7]。

假裸囊菌屬真菌(Pseudogymnoascusspp.)是低溫環(huán)境中常見的真菌類群。Pseudogymnoascuspannorum是假裸囊菌屬絲狀真菌，主要分布在南極或高山多年凍土中，在-5 ℃的環(huán)境中可以生長，最適生長溫度為15～18 ℃[8，9]。目前從假裸囊菌屬真菌中發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物非常少[10]，而P.pannorum中的次級代謝產(chǎn)物尚無文獻報道。本文首次對嗜低溫真菌P.pannorum中的次級代謝產(chǎn)物進行分離研究，從其大米發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到8個化合物，分別為：L-pyroglutamyl-L-phenylalanine(1)，(R)-N-acetyl phenylalanine(2)，(R)-N-acetyltryptophan(3)，methyl 2-hydroxy-4-(3-hydroxy-5-methylphenoxy)-6-methylbenzoate(4)，2-hydroxy-4-(2-hydroxy-3-methoxy-5-methylphenoxyl)-6-methylbenzoate(5)，vanillic acid(6)，1,3,5-三甲氧基苯(7)和亞油酸(8)。其中化合物1和2為首次從天然界分離得到，化合物3～8為首次從假裸囊菌屬真菌中分離得到。

圖1 化合物1～8的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1-8

1 材料

1.1 儀器與試劑

Jasco P-2000型旋光儀(Jasco公司，日本)；Bruker AV-III-500和Bruker AV-III-600 HD型核磁共振譜儀(布魯克公司，德國)；Agilent Technologies 6520 Accurate Mass Q-TOF LC/MS 型質(zhì)譜儀(安捷倫公司，美國)；Waters ACQUITY H-Class QDA超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(沃特世公司，美國；ACQUITY UPLC BEH色譜柱：1.7 μm，50 mm×2.1 mm，沃特世公司，美國)；SSI Series III半制備高效液相色譜儀(科學(xué)系統(tǒng)公司，美國；SSI Series 1500 Photo Diode Array Detector檢測器；YMC Pack ODS-A色譜柱：C18，5 μm，250 mm×10 mm，YMC公司，日本；Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl New Column色譜柱：5 μm，250 mm×10 mm，菲羅門公司，美國)；CombiFlash Rf+型中壓制備色譜儀(Teledyne Isco公司，美國)； MCI CHP 20P/P120填料(三菱化學(xué)株式會社，日本)；分析純試劑(乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇)購自北京化工廠；色譜純試劑(甲醇、乙腈)和質(zhì)譜純試劑(乙腈、水)購自美國Fisher公司。

1.2 菌種

實驗用菌種P.pannorum保藏于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室。

2 提取與分離

菌株P(guān).pannorum經(jīng)大米培養(yǎng)基(5 kg)16 ℃培養(yǎng)發(fā)酵30天后，將大米發(fā)酵物搗碎，加入2倍體積的乙酸乙酯超聲提取3次(每次超聲2 h)，合并提取液，減壓濃縮得到乙酸乙酯粗提物56.5 g。

取48.0 g乙酸乙酯提取物采用MCI柱層析分離，以甲醇-水(90∶10，100∶0，v/v)和丙酮進行梯度洗脫，得到組分F1～F3；對組分F1(10.0 g)進行中壓快速制備分離(C18柱，25～40 μm，甲醇-水梯度洗脫，5%～100%)，得到F1-1～F1-11流份；其中流份F1-2(377.5 mg)經(jīng)反相制備柱分離(YMC Pack ODS-A柱，乙腈-水等度洗脫，21∶79，0.02% HCOOH，v/v)得到化合物6(5.1 mg)和7(4.6 mg)；流份F1-5(211.7 mg)經(jīng)反相制備柱(YMC Pack ODS-A柱)分離，以乙腈-水(20∶80，0.02% HCOOH，v/v)等度洗脫，得到化合物1(9.3 mg)、2(1.7 mg)和3(2.2 mg)；流份F1-8(94.6 mg)采用反相制備柱(YMC Pack ODS-A柱，乙腈-水等度洗脫，59∶41，0.02% HCOOH，v/v)分離，得到化合物4(9.1 mg)和5(6.4 mg)。

另取8.0 g乙酸乙酯提取物進行MCI柱層析分離，以甲醇-水(10%～100%)和丙酮為溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，得到11個流份(A～K)；對流份I(3.2 g)采用中壓快速制備(C18柱，25～40 μm)分離，以甲醇-水溶液(5%～100%)為流動相梯度洗脫，得到化合物8(817.1 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物4無色油狀；1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:6.30 (1H,d,J=2.0 Hz,H-4),6.24 (1H,d,J=2.5 Hz,H-6),2.47 (3H,s,H-8),6.36 (1H,brs,H-10),6.50 (1H,brs,H-12),6.36 (1H,brs,H-14),2.28 (3H,s,H-15),3.94 (3H,s,CH3O-1)；13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:172.8 (s,C-1),109.3 (s,C-2),144.2 (s,C-3),113.3 (d,C-4),163.6 (s,C-5),103.7 (d,C-6),164.9 (s,C-7),23.8 (q,C-8),157.3 (s,C-9),105.7 (d,C-10),159.9 (s,C-11),113.1 (d,C-12),142.2 (s,C-13),113.6 (d,C-14),21.5 (q,C-15),52.4 (q,1-OCH3)。將以上數(shù)據(jù)與文獻對比[17]，鑒定化合物4為methyl 2-hydroxy-4-(3-hydroxy-5-methylphenoxy)-6-methylbenzoate。

化合物5無色油狀；1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:6.32 (1H,d,J=2.5 Hz,H-4),6.13 (1H,d,J=2.5 Hz,H-6),2.47 (3H,s,H-8),6.69 (1H,d,J=1.5 Hz,H-12),6.44 (1H,d,J=1.0 Hz,H-14),2.26 (3H,s,H-15),3.91 (3H,s,CH3O-1),3.87 (3H,s,CH3O-11)；13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:173.0 (s,C-1),108.4 (s,C-2),144.1 (s,C-3),112.4 (d,C-4),164.0 (s,C-5),102.4 (d,C-6),165.2 (s,C-7),23.9 (q,C-8),142.7 (s,C-9),137.7 (s,C-10),150.5 (s,C-11),110.7 (d,C-12),130.3 (s,C-13),115.9 (d,C-14),21.1 (q,C-15),52.3 (q,1-OCH3),56.7 (q,11-OCH3)。將以上數(shù)據(jù)與文獻對比[17]，鑒定化合物5為2-hydroxy-4-(2-hydroxy-3-methoxy-5-methylphenoxyl)-6-methylbenzoate。

化合物6白色無定型粉末；1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:7.56 (1H,brs,H-2),6.82 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5),7.54 (1H,d,J=9.0 Hz,H-6),3.89 (3H,s,CH3O-3)；13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:124.7 (s,C-1),115.8 (d,C-2),148.7 (s,C-3),152.3 (s,C-4),114.0 (d,C-5),125.2 (d,C-6),171.4 (s,C-7),56.2 (q,3-OCH3)。將以上數(shù)據(jù)與文獻對比[18]，鑒定化合物6為vanillic acid。

化合物7無色油狀；1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:7.33 (3H,s,H-2,4,6),3.88 (9H,s,CH3O-1,3,5)；13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:148.9 (s,C-1,3,5),108.4 (d,C-2,4,6),56.9 (q,CH3O-1,3,5)。將以上數(shù)據(jù)與文獻對比[19]，鑒定化合物7為1,3,5-三甲氧基苯(1,3,5-trimethoxybenzene)。

化合物8無色油狀；1H NMR (CD3OD,500 MHz)δ:5.34 (4H,m,H-9,10,12,13),2.78 (2H,t,J=6.5 Hz,H-11),2.27 (2H,t,J=7.0 Hz,H-2),2.07 (4H,dd,J=13.0,6.5 Hz,H-8,14),1.60 (2H,m,H-3),1.34 (14H,m,7×CH2),0.91 (3H,t,J=6.5 Hz,H-18)；13C NMR (CD3OD,125 MHz)δ:178.5 (s,C-1),35.5 (t,C-2),32.8 (t,C-3),30.4 (t,C-4),30.5 (t,C-5,6),30.6 (t,C-7),28.3 (t,C-8,14),129.2 (d,C-9),131.0 (d,C-10,12),26.7 (t,C-11),129.2 (d,C-13),30.9 (t,C-15),26.4 (t,C-16),23.8 (t,C-17),14.6 (q,C-18)。將以上數(shù)據(jù)與文獻對比[20]，鑒定化合物8為亞油酸(linoleic acid)。

以上化合物的核磁及其它相關(guān)詳細結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費下載(www.trcw.ac.cn)。

4 體外細胞毒活性篩選

采用CTG發(fā)光法將分離得到的化合物(1～8)進行人肝癌HepG-2細胞和人乳腺癌MCF-7細胞的細胞毒活性篩選。

將HepG-2和MCF-7細胞置于75 cm2組織培養(yǎng)瓶中加入含1.5 g/L碳酸氫鈉，10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2的溫箱中培養(yǎng)4天。棄去培養(yǎng)液并用PBS洗滌細胞。加1 mL Trysin-EDTA消化細胞使其達到80%融合。加3 mL DMEM或含F(xiàn)BS的RPMI 1640停止細胞消化。將細胞收集到15 mL離心管中，1 000 rpm離心3 min。棄上清，用3 mL新培養(yǎng)基懸浮成單細胞懸液。于96孔板內(nèi)接種，每孔100 μL(含3 000個細胞)，加篩選的化合物(1～8)和陽性對照藥紫杉醇?；衔锾幚砗蟮募毎?7 ℃下孵育72 h。72 h后，每100 μL培養(yǎng)基加入Cell Titer Glo試劑30 μL。最后，對每塊細胞板進行發(fā)光檢測，結(jié)果顯示活細胞的ATP水平。

結(jié)果表明，化合物1～8對人肝癌細胞HepG-2和人乳腺癌細胞MCF-7未顯示細胞毒作用(IC50> 50 μM)。

5 討論

嗜低溫真菌長期生存在低溫環(huán)境中，為了適應(yīng)極端的生存條件，它們可能形成特殊的生理代謝特征和特殊的次級代謝產(chǎn)物。P.pannorum為假裸囊菌屬嗜低溫真菌，本文對其次級代謝產(chǎn)物進行了化學(xué)成分的分離研究，共分離得到8個化合物，包括1個非核糖體肽類化合物(化合物1)、2個氨基酸衍生物(化合物2和3)、4個酚酸類化合物(化合物4～7)和1個不飽和脂肪酸(化合物8)。其中，亞油酸(化合物8)為該真菌次級代謝產(chǎn)物的主成分,大量不飽和脂肪酸的形成是否與嗜低溫真菌為適應(yīng)其生存環(huán)境而產(chǎn)生的特殊化學(xué)防御機制有關(guān)有待進一步研究。