趙 冉，蔡振鴻，陳 瓊，張丹英，楊 濤，連玉華

(1.廈門(mén)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，福建廈門(mén)361009；2.廈門(mén)市思明區(qū)市政管理中心，福建廈門(mén)361005)

H6 亞型禽流感病毒(AIV)為低致病性AIV，分布廣泛，主要感染水禽呈隱形感染，還可感染陸禽、鼠、水貂、豬，甚至人，危害不容忽視。2007年從廣西健康青年血液中檢出H6 亞型AIV 抗體[1]，2013年有H6N1 亞型AIV 感染人的病例報(bào)道[2]，證明H6 亞型存在跨宿主感染的風(fēng)險(xiǎn)。國(guó)內(nèi)主要流行過(guò)的H6 亞型有H6N2 AIV、H6N6 AIV。華東地區(qū)流調(diào)發(fā)現(xiàn)，2002年～2008年H6N2 AIV分離率較高，2009年后H6N6 AIV 分離率較高。H6N1、H6N5、H6N7、H6N8、H6N9 等其他亞型AIV 偶見(jiàn)報(bào)道。野鳥(niǎo)可攜帶H6 亞型AIV，20 世紀(jì)80年代，北美洲和歐洲野鳥(niǎo)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，H6 亞型是分離率最高的亞型之一[3-4]。亞洲地區(qū)多個(gè)國(guó)家也先后監(jiān)測(cè)到野鳥(niǎo)中H6 亞型的分布[5-8]。本研究對(duì)活禽屠宰場(chǎng)鴨群中分離到的4 株H6 亞型AIV 進(jìn)行全基因組序列測(cè)定、遺傳演化分析和特殊位點(diǎn)的氨基酸分析，掌握分子生物學(xué)信息，為該地區(qū)禽流感防控提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)樣品及主要試劑 檢測(cè)樣品采自廈門(mén)活禽屠宰場(chǎng)“待宰活禽”的咽喉及泄殖腔。HA AIV 通用診斷試劑盒購(gòu)自QIAGEN 公司；核酸提取試劑(MagMAXTM-97Viral RNA)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司；病毒RNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；測(cè)序反應(yīng)試劑盒BigDye Terminator 3.1 購(gòu)自美國(guó)ABI 公司。

1.2 病毒的分離與基因測(cè)序 樣品經(jīng)“全自動(dòng)核酸提取儀”提取核酸后(參照RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，“HA 禽流感病毒熒光定量PCR 通用診斷試劑盒”初篩，確認(rèn)為HA 流感病毒的陽(yáng)性樣本，送哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化及序列測(cè)定(該步驟由哈爾濱獸醫(yī)研究所崔鵬飛老師完成)。HA 檢測(cè)陽(yáng)性樣品用濾膜法過(guò)濾除菌后，接種10 日齡SPF 雞胚，37 ℃孵化72 h 后，收集含有最高血凝價(jià)、最大稀釋倍數(shù)的雞胚尿囊液，連續(xù)純化3 代后，按測(cè)序反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3 各基因節(jié)段序列遺傳進(jìn)化分析 借助Lasergene MegAlign 軟件對(duì)1.2 分離的病毒各基因節(jié)段氨基酸序列進(jìn)行同源性及關(guān)鍵位點(diǎn)的分析，利用MEGA5.2 分析軟件進(jìn)行各基因節(jié)段序列的遺傳進(jìn)化分析。通過(guò)Blast 比對(duì)得到與分離病毒株各基因節(jié)段具有最高同源性的病毒株。

2 結(jié)果與討論

2.1 病毒的分離與鑒定 從健康鴨群中分離到4 株H6N6 AIV，病毒命名如下A/duck/Fujian/SD013/2017(H6N6)(簡(jiǎn)稱(chēng)FJ13)；A/duck/Fujian/SD086/2017(H6N6)(簡(jiǎn)稱(chēng)FJ86)；A/duck/Fujian/SD099/2017(H6N6)(簡(jiǎn)稱(chēng)FJ99)； A/duck/Fujian/S1307/2017 (H6N6)( 簡(jiǎn) 稱(chēng)FJ307)。全基因序列上傳至GenBank (MG198925～MG198956)。

2.2 HA 基因及氨基酸序列分析 4 株H6N6 AIV HA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增測(cè)序后顯示，該基因1 701 bp，共編碼567 個(gè)氨基酸。4 株分離株HA 核苷酸序列比較，同源性90.7 %～99.5 %，其中FJ13 分離株與其他3 株同源性最低(圖1)。裂解位點(diǎn)的氨基酸序列為PQIETRGL，未見(jiàn)連續(xù)的堿性氨基酸，表現(xiàn)為低致病性AIV 的分子特征。受體結(jié)合位點(diǎn)239 (相當(dāng)于H3 亞型226 位點(diǎn))為Q，241 (相當(dāng)于H3 亞型228 位點(diǎn))為G，易與唾液酸α2-3 受體結(jié)合，表現(xiàn)禽感染嗜性，未發(fā)生人感染嗜性的突變。4 株分離株HA均含有7 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，分別為26NNS28、27NST29、39NVT41、306NKT308、311NVS313、498NGT500、557NGS559，與新疆野鳥(niǎo)糞便分離株A/WB/XJ/S1541(2015)(H6N6)[9]一致。其中FJ99 株與其他3 株分離株相比，在182 位多出1 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)182NNT185。結(jié)果表明，目前廈門(mén)這4 株分離株的HA基因序列仍表現(xiàn)為低致病性AIV 特征及禽感染嗜性，未發(fā)生人感染嗜性的突變。FJ99 株多出1 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，其是否對(duì)病毒毒力產(chǎn)生影響仍有待進(jìn)一步研究。

2.3 NA 基因及氨基酸序列分析 FJ13 分離株NA基因經(jīng)PCR 擴(kuò)增測(cè)序后顯示，該基因1 380 bp，共編碼460aa。4 株分離株NA 核苷酸序列比較，同源性92.4 %～99.4 %，其中FJ13 分離株與其他3 株同源性最低(圖2)。其頸部有11aa 的缺失，這種頸部序列的缺失有利于提高病毒株的毒力；6 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)51NET53、70NIT72、86NLT88、146NGT148、201NAS203、402NWS403，與新疆野鳥(niǎo)糞便分離株A/WB/XJ/S1541(2015)(H6N6)[4]一致。FJ86、FJ99、FJ307株NA 基因經(jīng)PCR 擴(kuò)增測(cè)序后顯示，該基因編碼區(qū)全長(zhǎng)1 413 bp，共編碼471aa，7 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，與FJ13 分離株相比增加67NFT69。結(jié)果表明，F(xiàn)J13 病毒株的基因序列存在毒力增強(qiáng)的分子特征。FJ86、FJ99、FJ307 株多出1 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，其是否對(duì)病毒毒力產(chǎn)生影響仍有待進(jìn)一步研究。

圖1 HA 基因的進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of HA gene

圖2 NA 基因的進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of NA gene

2.4 內(nèi)部基因及氨基酸序列分析 4 株分離株核苷酸序列比較，其中M 基因的同源性為93%～99.7%，NP 基因同源性為95.1 %～99.8 %，NS 基因同源性為99.3%～100%，PA 基因同源性為93.7%～99.7%，PB1 基因同源性為91.7 %～99.5 %，PB2 基因同源性為97.3 %～99.9 %，其中FJ13 分離株的內(nèi)部因節(jié)段與其它3 株同源性最低。內(nèi)部基因編碼氨基酸序列分析顯示，4 株分離株均出現(xiàn)M1 的N30D、T215A突變，NS1 P42S 突變，這些突變與病毒致病性增強(qiáng)或哺乳動(dòng)物嗜性相關(guān)。FJ13 的NS1 還出現(xiàn)了D92G突變。PB2、NP、PA 這3 個(gè)基因編碼氨基酸未見(jiàn)毒力相關(guān)位點(diǎn)的突變。M2 蛋白為離子通道，關(guān)鍵位點(diǎn)的突變與金剛烷胺類(lèi)藥物耐藥性相關(guān)。4 株分離株M 蛋白均出現(xiàn)V27I 的突變，提示這4 株分離株對(duì)金剛烷胺類(lèi)藥物耐藥性產(chǎn)生了變化。結(jié)果表明，4株分離株內(nèi)部基因編碼氨基酸均出現(xiàn)了與病毒致病性增強(qiáng)、哺乳動(dòng)物嗜性和耐藥性相關(guān)的突變。其中，M1 的N30D、T215A 突變與NS1 的P42S 突變與本地同一時(shí)期分離到的6 株H9N2 亞型相同，提示這幾個(gè)與宿主嗜性和毒力增強(qiáng)相關(guān)位點(diǎn)的變異已趨于穩(wěn)定，或者這兩種亞型相互間存在這兩個(gè)基因重組的現(xiàn)象。

2.5 分離株全基因的遺傳進(jìn)化分析 H6 亞型AIV分為歐亞分支和北美分支。其中歐亞分支又可以細(xì)分為ST339-like、ST2853-like、HN573-like、ST192-like、W312-like 分支等[10]?；蜻M(jìn)化樹(shù)顯示，4 株分離株HA 屬于歐亞分支中的ST2853-like 分支。FJ13的HA 基因序列與2015年浙江雞源分離株A/chicken/Zhejiang/74154/2015 (H6N6)(KU050780)的HA 基因序列同源性最高(98 %)；FJ86 的HA 基因序列與2013年江西鴨源分離株A/duck/Jiangxi/10304/2013(H6N6)(KP285309.1)的HA 基因序列同源性最高(98%)；FJ99 的HA 基因序列與2014年印度鴨源分離株A/duck/India/11CL01/2014 (H6N2)(KU598235.1)的HA基因序列同源性最高(97 %)；FJ307 的HA 基因序列與2013年江西鴨源分離株A/duck/Jiangxi/10304/2013(H6N6)(KP285309.1)HA 基因序列同源性最高(98 %)(圖1)。結(jié)果表明，分離株HA 基因序列與近年來(lái)流行的H6N6 病毒株HA 基因高度同源；部分分離株HA 來(lái)源于H6N2、H6N1 病毒株，或者與它們有著共同的來(lái)源。

基因進(jìn)化樹(shù)，4 株分離株NA 基因?qū)儆跉W亞分支。FJ13 的NA 基因序列與2016年浙江雞源分離株A/chicken/Zhejiang/234/2016 (H6N6)(KY056303.1)的NA 基因序列同源性最高(99 %)，F(xiàn)J86、FJ99、FJ307 的NA 基因序列與2007年福建鴨源分離株A/duck/Fujian/8089/2007(H6N6)(CY110154.1)的NA基因序列同源性最高(96 %)，并且與2014年越南鴨源H5N6 分離株A/muscovy duck/Vietnam/LBM757/2014(H5N6)的NA 基因序列親緣關(guān)系較近，有共同的來(lái)源(圖2)。結(jié)果表明，分離株NA 基因序列與歷年來(lái)流行的H6N6 病毒株NA 基因高度同源；3 株分離株NA 基因序列與H5N6 的HA 基因有共同的來(lái)源。

將分離株的8 個(gè)基因節(jié)段與國(guó)內(nèi)外H6 亞型病毒株進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。根據(jù)序列同源性(組內(nèi)同源性95 %以上)，15 株H6N6 亞型病毒株中NP、PB1 劃分為7 個(gè)Group，HA、PA 劃分為6 個(gè)Group，NA、M、PB2 劃分為5 個(gè)Group，NS 劃分為2 個(gè)Group，繪制基因圖譜?；驁D譜顯示，15 株H6N6 亞型病毒株表現(xiàn)為12 個(gè)基因型，4株分離株均分別屬于不同基因型。其中，F(xiàn)J13 株與2016年浙江雞源分離株A/chicken/Zhejiang/234/2016(H6N6)屬于同一個(gè)基因型(圖3)。

圖3 H6N6 病毒基因圖譜Fig.3 Genotypes of viruses

我國(guó)家禽中H6 亞型AIV 主要分離自南方水禽，2016年11 月～2017年3 月廈門(mén)活禽交易市場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，鴨群中主要為H6 亞型AIV，并存在與其它亞型AIV 混合感染的現(xiàn)象。本研究分離到4 株H6 亞型病毒，均為H6N6 亞型，分離自不同來(lái)源的鴨群，均屬于歐亞分支，遺傳演化呈現(xiàn)多樣性，其中FJ13 與其它3 株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。同源性分析顯示，3 株分離株的NA、NP、PA 等基因與2006年～2007年H6N2 和H6N6 病毒株同源性很高，可見(jiàn)10年前福建及周邊省份流行的H6N2 和H6N6 病毒株的部分內(nèi)部基因仍為本地區(qū)流行的H6N6 病毒株中的優(yōu)勢(shì)基因。本研究結(jié)果表明，4 株H6N6 AIV 均表現(xiàn)為低致病性AIV 特征，但也存在與耐藥性、毒力增強(qiáng)等相關(guān)的突變，屬于4 種不同的基因型，基因來(lái)源呈現(xiàn)多樣性。本研究初步了解該地區(qū)H6 亞型AIV 主要流行病毒株的分子進(jìn)化情況，為AI 防控提供科學(xué)依據(jù)。