■戴 甜 章文明 汪海峰

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院，浙江杭州311300；2.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

乳酸桿菌是一類能將碳水化合物發(fā)酵生成乳酸的革蘭氏陽性菌[1]，并已廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等相關(guān)行業(yè)，被公認為食品級安全產(chǎn)品。廣泛存在于人、畜、禽腸道、許多食品、物料及少數(shù)臨床藥品中[2]。其在自然界中的分類十分廣泛，至少包括20個屬，主要為：乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)等[3]。乳酸桿菌作為腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群，有著調(diào)節(jié)機體胃腸道菌群平衡，保持微生態(tài)平衡和預(yù)防傳染病等作用。其益生作用主要表現(xiàn)為：通過產(chǎn)生有機酸、乳酸等物質(zhì)調(diào)節(jié)腸道pH值、產(chǎn)細菌素抑制外來病菌的感染，并且在腸道內(nèi)能與黏膜上皮結(jié)合緊密，形成一層生物膜，排斥部分致病菌，也可以激活某些特定的免疫細胞，從而抑制外來菌種的生長和繁殖[4]。其次，研究表明乳酸桿菌發(fā)生益生效應(yīng)首先需在腸道內(nèi)成功定植，之后通過細胞膜與外界進行物質(zhì)交換和能量的傳遞。在腸道成功定植后，能產(chǎn)生丁酸和細菌素等活性代謝物。其中丁酸可以抑制很多突變物質(zhì)的活性，并參與細胞的凋亡和分化，細菌素則可抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見病原菌的生長[3，5]。乳酸桿菌可以降低腸道通透性和炎癥的發(fā)生，阻礙有害物質(zhì)對腸道屏障功能的損害，減弱細胞凋亡和自噬等[6]。

細胞膜位于細胞的最外層，是天然的高度選擇性的屏障，不僅參與細胞和外部環(huán)境之間的物質(zhì)交換，在細胞的生理過程中也有至關(guān)重要的作用，例如：作為信號通訊，誘導(dǎo)刺激細胞、參與細胞黏附、物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)換等[7]。細胞膜的存在有助于維持細胞穩(wěn)態(tài)，為細胞各種生理功能提供基礎(chǔ)，并且膜脂質(zhì)還參與一定的應(yīng)激功能。在充當(dāng)生物屏障的同時提供選擇通透性，這就決定了對細胞膜的認識是對整個細胞乃至生命體認識的基礎(chǔ)[8]。研究表明不同溫度和pH值條件下，細胞的選擇透過性表現(xiàn)出不同的差異。通過對細胞膜的研究可深入了解乳酸桿菌的生長代謝和生理狀態(tài)，并通過調(diào)節(jié)細胞膜的通透性改變膜的選擇性，從而調(diào)控細胞代謝[9]。同時，位于乳酸桿菌細胞膜表面一些蛋白質(zhì)、多糖、脂磷壁酸等物質(zhì)對于參與黏附定植有重要作用。

1 乳酸桿菌細胞膜及其結(jié)構(gòu)特征

1.1 乳酸桿菌細胞膜的結(jié)構(gòu)

細胞膜主要由磷脂、蛋白質(zhì)和少量的糖類構(gòu)成，并通過疏水鍵和氫鍵維持磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，以構(gòu)成細胞膜的基本構(gòu)架。根據(jù)功能的不同，可以將這些蛋白分為膜轉(zhuǎn)運蛋白、受體蛋白、連接蛋白和酶[10]。這些蛋白發(fā)揮著物質(zhì)運輸和離子交換的功能，并且可以催化某些生理生化反應(yīng)的發(fā)生，從而提高機體免疫功能，防止外來病菌的侵入[11]。乳酸桿菌是一種革蘭氏陽性菌，形狀為桿形，發(fā)酵過程中利用碳水化合物形成大量乳酸。乳酸桿菌擁有一類表層蛋白，分子量為25～71之間，是已知表層蛋白中最小的一類。等電點為9.35～10.4，均為堿性蛋白，是乳酸桿菌獨有的特征[12]。它廣泛存在于動植物腸道中通過代謝糖類，主要將其轉(zhuǎn)化為乳酸，廣泛應(yīng)用于肉類、蔬菜、水果、飲料、牛奶等食物的發(fā)酵過程中并且在腸道定植發(fā)揮益生效應(yīng)，他們在食物保藏扮演關(guān)鍵角色,導(dǎo)致食品口感和風(fēng)味的發(fā)展[13]。像大多數(shù)革蘭氏陽性菌一樣，乳酸桿菌細胞膜含有大量糖聚合物和蛋白質(zhì)，它由多層肽聚糖球囊周圍裝飾著磷壁酸、多糖和蛋白質(zhì)組成。其中參與乳酸桿菌細胞膜重要功能性成分包括：肽聚糖、磷壁酸、多糖、蛋白質(zhì)等[14](見圖1)。由于乳酸桿菌發(fā)揮的益生效應(yīng)，人們越來越認識到其細胞膜的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)是開發(fā)技術(shù)和健康應(yīng)用的重要組成部分。

圖1 乳酸桿菌表面結(jié)構(gòu)圖[19]

1.2 乳酸桿菌細胞膜的作用

通過對乳酸桿菌細胞膜的分析在破譯控制肽聚糖相關(guān)酶活性和細菌自溶的分子機制、細胞膜蛋白在細菌表面的錨定、噬菌體對靶細菌表面的吸附以及益生菌與細菌之間的相互作用方面有重要作用[15]。有研究顯示乳酸桿菌細胞膜膜中脂磷壁酸和肽聚糖參與了細胞黏附過程，表層蛋白中SlpA可以與纖維連接蛋白作用參與腸道定植[16]。乳酸桿菌在腸道成功定植后產(chǎn)生各個消化酶促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，并且可以增強外周血、T淋巴細胞、B淋巴細胞的活性，增強細胞免疫和體液免疫等功能[17]。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高黏附性乳酸桿菌ZJ617經(jīng)過抗體封閉表面蛋白GAPDH和氯化鋰去除表面蛋白后，乳酸桿菌的黏附數(shù)量明顯降低[18]，表明乳酸桿菌表面蛋白對于腸道定植有至關(guān)重要的作用。

2 影響乳酸桿菌細胞膜作用性因素

2.1 壓力

在高強度壓力下，對細胞主要損傷的是細胞膜，增大細胞的通透性甚至導(dǎo)致細胞死亡[20]。壓力作用于細胞導(dǎo)致細胞膜通透性增加的主要原理是細胞處在一定壓力下會使細胞膜磷脂分子橫切面積縮小，雙層結(jié)構(gòu)由此收縮，細胞膜通透性增大。多數(shù)研究認為超高壓破壞細胞膜是微生物死亡的主要原因[21]。有研究通過高壓均質(zhì)化（HPH）下對乳酸菌細胞膜脂質(zhì)酸組成的影響，有利于理解細胞膜激活反應(yīng)機制，在亞致死水平下進行的高壓均質(zhì)化處理可以增加非腸道益生菌菌株的一些重要功能和技術(shù)特征[22]。利用高壓CO2處理植物乳酸桿菌，并且對其生理狀態(tài)進行檢測，發(fā)現(xiàn)高壓下植物性乳酸桿菌的鹽耐受性、糖降解率以及酶的活性都隨之發(fā)生變化[23]。由此可知隨著壓力的增加，細胞膜通透性慢慢變大，到達一定程度后細胞失活。

2.2 冷凍干燥

冷凍干燥是保存益生菌的一種簡便方法。通過將水活度降低到0.2以下，它可以在超普拉茲羅溫度下進行長期儲存和低成本分配，同時將生存能力和功能損失降至最低[24]。其中通過細胞膜通透性的變化可以認識冷凍干燥對乳酸桿菌和益生菌的損傷機理。Castro[25]研究發(fā)現(xiàn)，保加利亞乳酸桿菌在凍干后，細胞內(nèi)離子失衡，Na+和K+濃度變化，說明細胞膜通透性變大，細胞發(fā)生損傷。凍干前后乳酸桿菌細胞存活率降低凝乳時間延長，酸度計pH值變化不大，代謝酶活性有所降低，熒光探針測定凍干后乳酸桿菌Ca2+濃度增加，表明細胞膜通透性增大[26]。有研究利用熒光探針(cFDA和PI)快速評估干酪乳桿菌在冷凍和凍干后的生存能力，用該方法測定了四種不同的低溫保護劑的保護效果。結(jié)果表明，低溫保護劑對提高細胞活力有積極作用。并對比菌種在凍干過程中的活力損失,發(fā)現(xiàn)細胞膜在凍干前后通透性有顯著增加[27]。

3 乳酸桿菌細胞膜對微生態(tài)制劑的影響

微生態(tài)制劑是指能促進正常微生物生長繁殖加強腸道微生物的屏障功能，防止有害病菌感染的微生態(tài)制品。乳酸桿菌作為微生態(tài)制劑的常用菌種對于改善動物腸道菌群平衡，以及預(yù)防和治療疾病等方面有重要意義。然而它在胃酸、膽鹽等高溫環(huán)境下具有不穩(wěn)定因素，影響其在動物腸道內(nèi)發(fā)揮的益生效應(yīng)。

3.1 乳酸桿菌微生態(tài)制劑的應(yīng)用

乳酸桿菌微生態(tài)制劑的應(yīng)用非常廣泛，在畜禽生產(chǎn)上，有研究利用乳酸菌制劑對犢牛腹瀉進行防治，結(jié)果表明乳酸菌對于犢牛腹瀉率與對照組相比下降2倍[28]。Schmidt等[29]將發(fā)酵過的甘蔗青貯飼料飼喂公牛，與對照組相比，公牛的平均日增重和飼料的利用率大幅提高，進而提高了公牛的生產(chǎn)性能。同時微生態(tài)制劑可以增強機體免疫力，Lakrrtz等給小鼠灌注羅伊氏乳桿菌發(fā)酵食物，發(fā)現(xiàn)僅口服這些純化乳酸菌就足以抑制兩種模型的乳腺瘤變特征[30]。并且在臨床醫(yī)學(xué)中已證明其在鼠李糖乳酸桿菌可以減少慢性炎癥，減少胃腸道惡性腫瘤和癌癥的發(fā)生[31]。因此對乳酸桿菌微生態(tài)制劑的研究在醫(yī)藥、生物、飼料等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

3.2 乳酸桿菌細胞膜在生長繁殖上的影響

乳酸桿菌微生態(tài)制劑受多種環(huán)境因素的影響，要想微生態(tài)制劑發(fā)揮腸道定植作用，一般要求微生態(tài)制劑的活菌數(shù)達到107CFU/ml，當(dāng)細胞膜通透性增加到一定程度時，可以快速吸收周圍環(huán)境中的自身所需物質(zhì)，從而提高產(chǎn)率。作者所在課題組在研究不同時間乳酸桿菌細胞膜通透性時發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌在對數(shù)生長期細胞膜通透性最大，此時乳酸桿菌生長狀態(tài)最高，繁殖速度最快（未發(fā)表）。因此通過調(diào)節(jié)細胞膜通透性，增加營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，有助于提高乳酸桿菌活菌數(shù)，進而提高微生態(tài)制劑的利用率。

3.3 乳酸桿菌細胞膜對微生態(tài)制劑冷凍保存的影響

近年來對乳酸菌制劑的研究越來越深入，主要采用凍干技術(shù)、微膠囊技術(shù)、生物發(fā)酵技術(shù)等制成不同種類的乳酸菌制劑[32]。其中凍干技術(shù)中，乳酸桿菌在冷凍保存過程中會造成一定的損傷，主要有機械損傷、溶質(zhì)損傷、蛋白質(zhì)變性、pH值平衡遭到破壞等，這些損傷會影響乳酸桿菌的生長繁殖，降低活性。通過對細胞膜凍干前后細胞膜通透性的比較發(fā)現(xiàn)，凍干之后細胞膜通透性顯著增加，由此可見冷凍保存過程中細胞活性的降低與細胞膜通透性的增加有關(guān)[26]。因此通過調(diào)節(jié)細胞膜通透性可以緩解冷凍保存對乳酸桿菌的傷害，使菌種穩(wěn)定保存，從而在微生態(tài)制劑制作工程中，降低對乳酸桿菌的凍干損傷，對于提高作用率有重要意義。

3.4 乳酸桿菌細胞膜對腸道定植的影響

乳酸桿菌在腸道定植是發(fā)揮一系列生理功能的基礎(chǔ)。微生態(tài)制劑在腸道內(nèi)發(fā)揮作用的前提同樣是在腸道內(nèi)成功定植。影響乳酸桿菌腸道定植的因素有很多，菌體膜外表面有大量參與腸道定植的物質(zhì)。脂磷壁酸是乳酸桿菌特征性膜結(jié)合聚合物，作為細胞壁的重要組成成分。有研究發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌中脂磷壁酸丙氨酸殘基的缺失，顯著影響了其在小鼠胃腸道中生物膜的形成能力[33]。從而使乳酸桿菌在腸道內(nèi)定植能力減弱，降低微生態(tài)制劑在動物腸道中的利用率。然而乳酸桿菌微生態(tài)制劑腸道定植后又能發(fā)揮一系列功能。作者所在課題組研究乳酸桿菌與腸上皮細胞黏附的關(guān)鍵表面蛋白，發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌表面37 kDa的表面蛋白GAPDH在腸道黏附中具有重要作用[18]。與未處理的菌株相比，通過用LiCl處理去除表面蛋白或通過用抗GAPDH抗體阻斷，羅伊氏乳桿菌ZJ617黏附上皮細胞的能力顯著降低。免疫電鏡和免疫熒光分析證實GAPDH位于羅伊氏乳桿菌ZJ617的表面層[18]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌生長過程中表面蛋白GAPDH含量與細胞膜通透性成正相關(guān)（未發(fā)表）。這些研究表明乳酸桿菌膜上蛋白對于參與腸道定植有重要作用，從而對微生態(tài)制劑的研究有重要意義。

鑒于乳酸桿菌細胞膜對微生態(tài)制劑的影響，通過調(diào)控乳酸桿菌細胞膜相關(guān)理化性質(zhì)，實現(xiàn)益生菌之間的相互轉(zhuǎn)化，使乳酸菌微生態(tài)制劑的應(yīng)用更加廣泛。

4 總結(jié)

乳酸桿菌作為無毒、無害、無殘留、無污染的微生態(tài)制劑，具有維持動物消化道微生物區(qū)系平衡，增強畜禽的抗病能力和提高動物生產(chǎn)性能等優(yōu)點，可作為綠色畜禽養(yǎng)殖中理想的抗生素替代品。然而其易受到各種環(huán)境因素的影響，如pH值、溫度等都會使乳酸桿菌的生長受到抑制。為了更好發(fā)揮乳酸桿菌的益生作用，越來越多的研究著重于提高乳酸桿菌的自身生長代謝。通過調(diào)控細胞膜通透性允許營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞，并將代謝產(chǎn)物排除體外，從而增強細胞與外界物質(zhì)交換的速度[9]。并且通過對膜上蛋白物質(zhì)進行理化分析，高效利用因此調(diào)控細胞膜通透性可以作為增強乳酸桿菌生長繁殖的重要方法。具體可以表現(xiàn)在提高乳酸桿菌自身合成物質(zhì)，例如影響腸道定植蛋白，通過影響細胞膜通透性排出胞外，借此加強腸道定植功能，使乳酸桿菌更高效的發(fā)揮一系列的益生作用有重要意義。然而如何將乳酸桿菌細胞膜特定功能在益生菌之間轉(zhuǎn)化，是工作的一大難點，還需要對乳酸桿菌細胞膜進行更深入的研究。同時可以通過對細胞膜的檢測與監(jiān)控，了解到乳酸桿菌的生長狀態(tài)，探究乳酸桿菌作用機理，對于研究乳酸桿菌微生態(tài)制劑有重要意義。