陳匡陽(綜述) 王宣春(審校)

(復旦大學附屬華山醫(yī)院內分泌科-復旦大學內分泌糖尿病研究所 上海 200040)

內質網(wǎng)膜蛋白復合物(endoplasmic reticulum membrane protein complex,EMC)是一種多功能、多亞基的蛋白質復合物,目前在脊椎動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EMC1-7、8a、8b、10。在蛋白質組學研究中發(fā)現(xiàn)EMC參與內質網(wǎng)相關蛋白質的降解(ER-associated degradation)[1]、與線粒體形成內質網(wǎng)-線粒體栓[2]、多跨膜蛋白質的正確裝配[3]等細胞內多種生物活動過程。EMC基因在物種進化過程中具有高度保守性[2,4-5]:EMC不僅在真菌和動物中有所表達,在古蟲、變形蟲、綠藻、植物、不等鞭毛類、囊泡蟲類、有孔蟲界、定藻門等多種微生物中均能找到EMC的同源基因。

人內質網(wǎng)膜蛋白復合物10(endoplasmic reticulum membrane protein complex subunit 10,EMC10)具有兩種異構體:分泌型EMC10 (EMC10-1和膜型EMC10 (EMC10-2)。在研究人胰島素瘤組織時,通過測序及構建cDNA文庫,本課題組[6]曾篩選出人EMC10-1的全長cDNA,將其編碼的蛋白質命名為INM02(insulinoma 02),發(fā)現(xiàn)該蛋白質也參與胰島素瘤組織的分泌通路,同時預測該蛋白質含有一段信號肽。隨后我們研究INM02的功能,證實胰島β細胞中EMC10-1的分泌受葡萄糖調節(jié)[7]。雖然最初認為酵母中只含EMC1-6[8],但EMC10同源基因YDR056C后續(xù)也在啤酒酵母中被發(fā)現(xiàn)[5],且進化分析提示大多數(shù)菌類都存在EMC10同源基因?？梢娕cEMC家族其他蛋白質相同的是,EMC10基因在物種進化中也具有高度保守性。本文從基因特點、蛋白結構到生物學功能,對EMC10基因和蛋白質進行介紹,為進一步研究EMC10在生命活動中的功能機制提供支持。

EMC10基因特點人EMC10基因位于19號染色體長臂上(19q13.33),全長約16.5 kb,人EMC10蛋白有2個同源異構體,即EMC10-1和EMC10-2。EMC10-1和EMC10-2基因均由12個外顯子組成,長約3 kb,而完全編碼序列(coding sequence,CDS)均由7個外顯子組成,僅最后一個外顯子有所差別[4]。EMC10-1基因的CDS長度為765 bp,編碼254個氨基酸,EMC10-2基因的CDS區(qū)長度為789 bp,編碼262個氨基酸。根據(jù)發(fā)現(xiàn)時的不同特點,EMC10-1又命名為INM02[7]、HSS1[4]、Mitra22[9]及C19orf63[4,10]等,EMC10-2又命名為HSM1[4]。

EMC10蛋白結構特點人EMC10-1是由254個氨基酸組成的分泌蛋白質,其N-端具有一段長度為27個氨基酸的信號肽,但不含跨膜區(qū)[4,10]。人EMC10-2是由262個氨基酸組成的單次跨膜蛋白質,包含一個胞外N-端信號肽(信號肽由27個氨基酸組成)、一個跨膜區(qū)(19個氨基酸組成)和一個多聚甘氨酸尾C-端。本課題組[7]用ELISA方法成功檢測到人血清中的 EMC10-1(即INM02)。Junes-Gill等[4]等用帶有6*His tag的EMC10-1重組質粒瞬時轉染293T細胞,用Western blot方法在培養(yǎng)細胞的無血清培養(yǎng)液中也檢測出了EMC10-1蛋白。Reboll等[10]等分別將EMC10-1和EMC10-2的過表達質粒轉染至293細胞后,用免疫沉淀方法發(fā)現(xiàn)EMC10-2僅存在于細胞裂解產物中,而EMC10-1在細胞裂解產物和細胞培養(yǎng)液中均能檢測出,去除EMC10-1信號肽端或者在EMC10-1過表達質粒轉染液中加入蛋白質轉運抑制劑Brefeldin A,則無法再在細胞培養(yǎng)液中檢測出EMC10-1。以上研究結果均證明EMC10-1是一種分泌蛋白質,而EMC10-2是一種跨膜蛋白質。

經(jīng)預測,EMC10-1蛋白多肽鏈的第182和第198個氨基酸位置可能為糖基化位點,使用不同的糖鏈水解酶分別對細胞內的EMC10-1蛋白和分泌至上清液中的EMC10-1蛋白進行處理,發(fā)現(xiàn)前者的分子量并未減少,而后者的蛋白質表觀分子量逐漸減少,提示該蛋白質在分泌過程中伴隨著復雜的糖基化修飾過程[4]。

對EMC10-1/EMC10-2蛋白序列的三維結構進行預測,發(fā)現(xiàn)該蛋白質和一種人工合成的蛋白質TOP-7在三維結構上具有同源性[4,15],這種人工合成的蛋白質在極端溫度和pH環(huán)境下均具有穩(wěn)定性,提示EMC10蛋白質在物理特性上也可能存在類似的穩(wěn)定性。

EMC10蛋白分布特點本課題組曾以SD大鼠為研究對象,克隆大鼠同源EMC10-1 (INM02)基因,研究EMC10-1 mRNA在組織中的分布情況[7],Northern blot結果顯示EMC10-1 mRNA在大鼠組織中廣泛表達,尤其是胰腺組織、睪丸組織和膀胱組織中。在胰腺組織中,免疫組化進一步顯示EMC10-1主要集中于胰島細胞,而幾乎不存在于胰腺的外分泌組織。Junes-Gill等[4]用EMC10-1過表達質粒轉染人膠質瘤細胞株A172細胞后,免疫組化顯示EMC10也定位于細胞核,提示EMC10-1可能與成纖維細胞生長蛋白、表皮生長因子一樣,同時具有細胞內和細胞外功能特性[16]。小鼠分泌型EMC10也廣泛分布于腦組織的神經(jīng)元中,主要存在于神經(jīng)元胞體中,同時在囊泡、樹突軸中也有所表達[9]。Delgado-vega等[17]發(fā)現(xiàn)EMC10雖然在全身各組織均有分布,但在腎上腺、心耳、腎皮質、垂體、骨骼肌、子宮、睪丸中表達較多,其中在垂體中表達量最高。

EMC10蛋白的生物學功能

EMC10-1影響糖代謝 本課題組[7]前期研究中用高糖(25 mmol/L)和低糖(5.5 mmol/L)對胰島細胞系(Min6細胞)、原代胰島細胞干預不同時間,分別測定EMC10-1的mRNA和蛋白質水平。干預24和48 h時,無論在Min6細胞還是胰島細胞中,高糖干預組的EMC10-1 mRNA和蛋白質水平均明顯高于低糖干預組。實驗表明高糖能增加胰島細胞和Min6細胞中胰島素的表達,為了排除胰島素對EMC10-1表達的影響,將Min6細胞和胰島細胞用不同濃度的胰島素處理,結果發(fā)現(xiàn)各組EMC10-1 mRNA水平并無差異。由此推測EMC10-1的表達和分泌一定程度上受血糖濃度的影響,這種分泌模式可能與血糖調節(jié)胰島素分泌的模式相似,但EMC10-1的表達和分泌不受胰島素的影響。

用核磁共振氫譜(1H-NMR)方法檢測EMC10敲除小鼠的血漿,發(fā)現(xiàn)雌性小鼠血漿中的β-羥丁酸和2,3-丁二醇明顯增加,而用傳統(tǒng)的臨床化學方法和組織病理方法并未發(fā)現(xiàn)EMC10敲除小鼠血漿中生化指標的任何改變[18]。臨床研究發(fā)現(xiàn)胰島素瘤患者血漿中的β-羥丁酸濃度也明顯升高[19-20],胰島素瘤患者具有高胰島素血癥和低血糖的特點,機體血糖濃度降低,脂肪動員增加,會引起酮體增多。糖尿病患者胰島素分泌相對或絕對不足,外周組織糖利用障礙,同樣會造成脂肪動員增加,當胰島素補充不足、血糖控制不佳時,就會出現(xiàn)糖尿病酮癥酸中毒。這些都與1H-NMR方法檢測到的EMC10敲除小鼠血漿中β-羥丁酸的變化相一致,由此推測EMC10基因的敲除可能對糖代謝過程產生影響,但是這種影響雖然造成血漿中β-羥丁酸升高,卻還未達到引起酮血癥的程度。

體現(xiàn)現(xiàn)代學徒制特色既然是師徒制評價體系，評價的主體首先應該是徒弟和師傅，同時學校派出的指導老師也應積極參與到評價中來，社會第三方評價更是客觀評價師徒制教學效果的力量，不同的評價主體以不同的側重對師徒制教學效果給出不同的評價，互相印證得到比較公平客觀的結果。因此評價主體概括起來就應包括師傅評價、學生自評、學生互評、導師評價、認證機構評價、社會用人單位評價和家長評價。

EMC10-1抑制膠質瘤生長 Junes-Gill等[4,11]從純化的人造血干細胞中克隆到EMC10-1,將其命名為HSS1,并將其另一個膜型剪切異構體EMC10-2命名為HSM1。體外研究發(fā)現(xiàn),EMC10-1過表達使膠質瘤細胞株的增殖減少、接觸抑制減弱。對EMC10-1過表達膠質瘤細胞周期進行分析發(fā)現(xiàn),在A172和U87膠質瘤細胞系中,處于G0/G1期的細胞數(shù)均減少,而在A172細胞中處于S期和G2/M期的細胞數(shù)增多,由此推測EMC10-1并非特異性調節(jié)細胞周期某個環(huán)節(jié),而是總體上延長增殖時間。

與對照組相比,EMC10-1過表達使膠質瘤細胞軟瓊脂集落形成數(shù)明顯減少,集落大小明顯減小,因細胞形態(tài)改變與惡性腫瘤形成有關,該結果提示EMC10-1能減輕膠質瘤細胞的惡性程度,有恢復細胞接觸抑制的趨勢。將膠質瘤細胞U87和過表達EMC10-1的U87細胞分別移植入免疫缺陷小鼠,后者存活時間更長,提示EMC10-1在體內也能減少膠質瘤細胞的惡性程度。因為腫瘤新生血管內皮形成是轉移和侵襲的重要環(huán)節(jié),將EMC10-1過表達的膠質瘤細胞與人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)共培養(yǎng),EMC10-1抑制了HUVECs的侵襲和轉移。用EMC10-1直接干預HUVECs得到相同的結果,表明EMC10-1會抑制內皮細胞的新生血管形成。

EMC10-1不僅能抑制膠質瘤細胞株的增殖、遷移及侵襲,還能夠抑制內皮細胞的新生血管形成,提示EMC10-1是治療惡性膠質母細胞瘤潛在的靶點。

EMC10影響神經(jīng)元發(fā)育 構建Df(16)A+/-小鼠模型以模擬人22q11.2染色體微缺失引起的精神異常和認知功能障礙[21-23],發(fā)現(xiàn)Df(16)A+/-小鼠海馬體和腦皮質中miRNA-185表達較正常小鼠減少70%～80%,而EMC10-1基因表達明顯上調。

與之相同的是,EMC10基因的表達在Dgcr8+/-小鼠中也明顯上調,已知DGCR8對miRNA的合成具有重要作用,22q11.2微缺失也會導致DGCR8基因受影響[24],因此提示Df(16)A+/-小鼠EMC10表達上調可能與miRNA的失調有關。miRNA雖然并不編碼氨基酸,但對mRNA的穩(wěn)定和轉錄有調節(jié)作用[25-28]。進一步研究發(fā)現(xiàn)EMC10是miRNA-185作用的下游靶蛋白,miRNA-185下調會引起EMC10表達增加,且miRNA-185減少會引起神經(jīng)元樹突和樹突棘發(fā)育受損,增加miR-185活性則能逆轉Df(16)A+/-小鼠表現(xiàn)出的神經(jīng)元軸突及樹突棘發(fā)育障礙。實驗證明增加EMC10表達水平,野生型小鼠海馬體神經(jīng)元樹突和樹突棘發(fā)育受損增加,初級神經(jīng)元的樹突和總分支點的數(shù)量減少,而減少神經(jīng)元EMC10的表達能部分挽救神經(jīng)元樹突和樹突棘發(fā)育的缺陷。動物實驗證明,減少EMC10的表達能增加Df(16)A+/-小鼠胚胎發(fā)育時期神經(jīng)元軸突和樹突棘形成,這與嬰兒腦組織中EMC10表達水平較低相一致[29]。

為進一步探究降低EMC10表達水平能否恢復Df(16)A+/-小鼠所表現(xiàn)出的認知和行為異常,該課題組[30]又構建了Df(16)A+/-/Emc10+/-小鼠。已知Df(16)A+/-小鼠和精神分裂癥患者一樣會出現(xiàn)興奮性增高、前脈沖抑制(prepulse inhibition decrease,PPI)減少、工作記憶(working memory,WM)異常、社會記憶(social memory,SM)缺失、聯(lián)想記憶(associative memory,AM)缺失的表現(xiàn),而Df(16)A+/-/Emc10+/-小鼠能挽救Df(16)A+/-小鼠表現(xiàn)出的PPI減少、WM異常和SM缺失,但是無法改善興奮性增高、聯(lián)想記憶缺失的癥狀。降低EMC10的表達還能恢復Df(16)A+/-小鼠前額皮層突觸可塑性,預防神經(jīng)元結構改變。

由此可見,EMC10對于胚胎發(fā)育時期神經(jīng)元樹突和樹突棘結構的成熟和發(fā)育具有抑制作用,且EMC10基因的表達受miRNA-185的調節(jié),正常狀態(tài)下miRNA-185限制EMC10基因的表達,以避免后者在胚胎發(fā)育期對神經(jīng)發(fā)育產生抑制。動物實驗證實,EMC10基因缺失能部分挽救精神分裂癥的癥狀,這可能也與EMC10抑制成年期神經(jīng)回路正常有關。

EMC10-1/EMC10-2促進缺血心肌的組織修復Reboll等[10]對急性心梗(acute myocardial infarction,AMI)患者骨髓細胞進行分泌蛋白質組學分析的時候發(fā)現(xiàn),分泌蛋白EMC10-1具有血管形成的生物學活性。

過表達EMC10-1和EMC10-2使內皮細胞增殖增加、劃痕實驗刮痕處的修復率增加,這種增加效應與血管內皮生長因子的效應相當。去除EMC10-1和EMC10-2的信號肽段則上述促血管形成現(xiàn)象消失,提示EMC10的兩種變構體均需通過分泌途徑發(fā)揮促進血管形成的作用。用重組EMC10 (3、10、30、100、300 ng/mL)直接干預人冠脈內皮細胞,也有相同的促血管形成作用,且EMC10的促血管形成作用具有濃度依賴性。

信號通路研究發(fā)現(xiàn),EMC10通過依次激活小G蛋白、PAK2、p38 MAPK、MK2、HSPB1的磷酸化,促進肌動蛋白聚合和內皮細胞遷移。該信號通路被相應抑制劑所阻斷時,EMC10促進內皮細胞刮痕修復作用也被抑制。用AMI小鼠模型的心梗和非心梗組織進行體外實驗,發(fā)現(xiàn)EMC10能促進前者內皮細胞生長,這種作用不僅與血管內皮生長因子的作用相當,而且能被p38 MAPK抑制劑所阻斷。EMC10對于MK2基因敲除小鼠的心梗組織無促內皮細胞生長的作用。

進一步研究發(fā)現(xiàn),小鼠心梗后3天,EMC10-1和EMC10-2在心梗組織和血漿中的含量均明顯增加。流式細胞術分析顯示,心梗區(qū)單核細胞和巨噬細胞中的EMC10表達明顯多于中性粒細胞、T細胞、B細胞及內皮細胞。無論在心梗模型還是假手術模型中,骨髓、脾臟、外周血中的單核細胞和巨噬細胞EMC10-1/EMC10-2表達量均多于其他細胞。分離心梗模型小鼠心梗區(qū)、骨髓、脾臟中的單核細胞,培養(yǎng)24 h,在3種來源的單核細胞上清中均能檢測到EMC10-1。由此推測心梗后的EMC10主要由單核細胞和巨噬細胞分泌。

Emc10-/-小鼠心梗區(qū)的新生毛細血管密度、p-HSPB表達量明顯少于野生型(wild type,WT)小鼠,其心梗面積、左室重塑、心肌收縮功能紊亂都比WT小鼠嚴重。將WT小鼠的骨髓細胞移植給EMC10-/-小鼠可以增加后者體內EMC10的表達、心梗區(qū)血管形成,改善左室重塑和心肌收縮功能。但將EMC10-/-小鼠的骨髓移植給WT小鼠,則會損傷WT小鼠心梗后新生血管形成、增加梗死面積、加劇左室重塑和心肌收縮功能紊亂。用EMC10 (10 μg/天)干預治療心梗小鼠7天后發(fā)現(xiàn),毛細血管密度、p-HSBP1表達量、再灌注毛細血管數(shù)均有所增加,心梗面積減少、左室重塑和心肌收縮功能紊亂減輕,這種作用能維持到心梗后28天。

作為一個骨髓源性血管形成生長因子,EMC10主要由單核細胞和巨噬細胞分泌,通過小G蛋白-PAK2-p38 MAPK-MK2-HSPB1信號通路,發(fā)揮其促進心梗后新生血管形成的作用,EMC10短暫的干預治療有望為治療AMI贏得時間窗。動物實驗表明,AMI 3天后小鼠血漿和心梗區(qū)EMC10的2個同源異溝體含量均明顯升高,提示EMC10可能具有預測心梗的潛在價值。

EMC10調控精子成熟和雄性生育 本課題組前期構建了EMC10基因敲除小鼠模型[31],在研究純合子小鼠的表型過程中發(fā)現(xiàn)EMC10-/-雄性小鼠完全不育,EMC10-/-雌性小鼠生育力下降,因此進一步探究了EMC10在調控精子成熟和雄性生育過程所發(fā)揮的作用。

體外授精實驗結果顯示,無論是否去除卵母細胞外的透明帶,EMC10-/-精子均無法使卵母細胞受精而發(fā)育到二細胞階段,而通過胞漿內單精注射技術,EMC10-/-精子能使卵子受精并發(fā)育成正常的胚胎,提示EMC10參與精卵的受精過程。

與WT小鼠相比,Emc10-/-小鼠的附睪重量以及睪丸和附睪形態(tài)結構均無明顯異常,但EMC10-/-精子運動能力顯著下降、獲能受到抑制、自發(fā)頂體反應數(shù)量減少,從附睪分離出的EMC10-/-精子在體尾結合處出現(xiàn)發(fā)夾樣折疊,而睪丸分離的精子并未出現(xiàn)這種形態(tài)學上的異常。表明EMC10不影響精子發(fā)生,也不影響睪丸和附睪的發(fā)育,但對精子在附睪中的成熟和維持精子從睪丸移動到附睪過程中的正常形態(tài)具有重要作用。

蛋白質組學分析和Western blot檢測均發(fā)現(xiàn),EMC10缺乏會導致Na/K-ATP酶的α亞基ATP1A4和β亞基ATP1B3表達幾乎完全缺失,造成EMC10-/-精子內的Na+濃度顯著升高。用含有HCO3-的培養(yǎng)液孵育EMC10-/-精子和WT小鼠的精子,發(fā)現(xiàn)HCO3-誘導的pH值升高在EMC10-/-精子被明顯抑制。因此,EMC10對于維持精子細胞內Na+和HCO3-平衡有重要作用。

臨床樣本檢測發(fā)現(xiàn),弱精癥患者精液中的EMC10蛋白質表達水平較正常組下降,EMC10蛋白質表達水平與精子運動能力呈正相關,可見EMC10參與人精子運動能力的調節(jié)過程,精子中EMC10水平的降低可能是男性不育的原因之一。

EMC10通過影響精子的運動能力、頂體反應、精子獲能和精子的正常形態(tài),在雄性生育中發(fā)揮必要作用。EMC10可維持精子細胞內Na+和HCO3-平衡,這被認為是EMC10調控雄性生育能力的重要機制。弱精子癥患者的精子中EMC10表達減少,而EMC10表達與精子運動力呈正相關性,這使EMC10有望成為男性不育的生物學標志物和潛在的藥物治療靶點。對精子成熟過程發(fā)揮主要作用的是EMC10-1還是EMC10-2,仍需進一步研究。

結語綜上所述,雖然EMC10-1和EMC10-2在氨基酸組成上僅相差8個氨基酸,但是所發(fā)揮的生物學功能不盡相同。目前對于EMC10的研究主要集中于其作為分泌蛋白質的功能研究,主要涉及糖代謝、腫瘤生長、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、雄性不育方面。EMC10基因與多種自發(fā)免疫性疾病相關基因存在相互作用關系[17],SLE患病基因與FAM71E1/EMC10基因在人群和家族水平呈連鎖不平衡性。

不同濃度EMC10對于血管生成可能具有相反作用。Junes-Gill等[11]在研究膠質瘤時發(fā)現(xiàn),與對照組相比,濃度為200和500 nmol/L的EMC10對血管形成有抑制作用的,且濃度500 nmol/L時的抑制作用更明顯,而Reboll等[10]發(fā)現(xiàn)EMC10能促進小鼠心梗區(qū)新生毛細血管形成。因此推測,EMC10對血管形成的作用與濃度有關,在濃度較低時具有促血管形成作用,而在濃度較高時則抑制血管形成。

EMC10作為內質網(wǎng)膜蛋白復合物家族的一員,是否參與內質網(wǎng)蛋白質的折疊或降解過程？ EMC10的另一個變構體EMC10-2主要發(fā)揮何種生物學功能？全面研究EMC10的生物學功能將為了解代謝性疾病、精神疾病、神經(jīng)發(fā)育障礙、心梗組織修復、男性不育提供新思路,闡明EMC10與疾病相關的作用模式,將為治療疾病提供新的治療靶點。