李 冰(綜述) 鐘蕓詩(審校) 周平紅

(1復旦大學附屬中山醫(yī)院內鏡中心 上海 200032; 2上海消化內鏡診療工程技術研究中心 上海 200032)

炎癥和持續(xù)性感染在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、惡性轉化、侵襲、轉移等不同階段都起著關鍵作用。炎癥會誘導包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和中性粒細胞在內的免疫應答[1]。炎性小體是近年來新發(fā)現(xiàn)的固有免疫系統(tǒng)中的多蛋白復合物,其基本組分是NOD樣受體(NOD-like receptor,NLR)等蛋白質家族作為受體蛋白、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)作為接頭蛋白、半胱天冬酶-1(caspase-1)作為效應蛋白。由于ASC和caspase-1結構較為固定,而受體蛋白種類復雜,因此以受體蛋白對炎性小體進行分類。此外,經典的炎性小體反應途徑主要為,活化的caspase-1促使IL-1β、IL-18等炎性細胞因子成熟,啟動炎癥相關的細胞程序性死亡,即細胞焦亡(pyroptosis)[2]。此外,組成炎性小體的NLR等不同受體蛋白除可以通過炎性小體的經典反應途徑外,也可通過其他非炎性小體途徑影響疾病的發(fā)生發(fā)展。

最新腫瘤發(fā)病和致死統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,結直腸癌作為最常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤,其病死率高居全球第2位[3]。同時,包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病在內的炎性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)已被證實為結直腸癌發(fā)病的高危因素[4]。因此,炎性小體作為炎癥反應的重要環(huán)節(jié),在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。本文就不同炎性小體在結直腸腫瘤中的作用、相關機制和治療潛能等研究進展進行歸納總結,另外個別受體蛋白還通過非炎性小體途徑進行作用,因此也對這類機制進行了闡述。

NLRP3

NLPR3的結構和激活 NLRP3是目前研究較為深入的炎性小體組成分子。其屬于NLR蛋白質家族,由熱蛋白結構域(pyrin domain,PYD),核苷酸結合寡聚化結構域(nucleotide-binding and oligomerization domain,NACHT),以及富含亮氨酸重復序列(leucine-rich repeats,LRR)組成[5]。NLRP3能夠對病原相關分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)和損傷相關分子模式(damage associated molecular pattern,DAMP)等炎癥反應相關的外源性和內源性信號產生反應,從而啟動固有免疫應答[6]。NLRP3炎性小體主要在免疫相關細胞中表達,特別是抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells,APC)和炎癥刺激后大量產生的細胞,如巨噬細胞,樹突狀細胞,中性粒細胞[7]。關于NLRP3炎性小體的激活,以往研究認為Toll樣受體(toll-like receptors,TLR)通過識別PAMP或DAMP產生自身磷酸化并導致核因子-κB(NF-κB)活化,進而刺激NLRP3炎性小體組成分子的轉錄翻譯,及前體IL-1β和前體IL-18的表達[8-9]。此外,胞質內鉀、鈣離子的轉運,溶酶體組織蛋白酶-B的釋放會促進非活性的炎性小體及前體IL-1β和IL-18活化、成熟和上調[10-11]。值得注意的是,陳志堅研究組最新研究[12]發(fā)現(xiàn),NLRP3的多種差異極大的激動劑均能引起細胞內的反式高爾基體網絡(trans-golgi network,TGN)解體成分散的特殊結構dTGN(dispersed TGN)。dTGN形成以后,其膜上富集的負電磷脂PtdIns4P會招募原本處于細胞質內的NLRP3到dTGN上組裝成激活的炎性小體,這一發(fā)現(xiàn)從一個新的層面揭示了NLRP3炎性小體激活的機制。

NLRP3與結直腸腫瘤的關系及作用機制 NLRP3炎性小體在結直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展中的研究主要集中于其在結腸炎相關腸癌中的作用機制。雖然炎癥通常被認為是針對損傷因素和感染起保護作用的有益反應,但IBD等慢性腸道炎癥被認為是結直腸癌發(fā)生的危險因素[13]。當使用氧化偶氮甲烷 (azoxymethane,AOM)/葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)結腸癌誘發(fā)模型時,由于炎癥反應升高和腸上皮屏障遭到破壞,Nlrp3_/_小鼠出現(xiàn)了不典型增生和腫瘤的形成。并且,在炎性小體成分ASC和caspase-1靶向缺失的小鼠中,研究者觀察到類似的結果,從而證實了NLRP3炎性小體在抵抗結腸炎相關腫瘤發(fā)生過程中起著關鍵作用[14-15]。進一步對NLRP3炎性小體在結直腸腫瘤發(fā)生中的作用機制進行探究,發(fā)現(xiàn)在NLRP3和caspase-1缺陷的AOM/DSS結腸癌誘發(fā)小鼠模型中,腸道中的IL-18顯著降低,而使用重組IL-18可有效阻止腫瘤的發(fā)展[15]。此外,經AOM/DSS處理的Il18_/_和Il18r1_/_小鼠相對野生型小鼠也更易發(fā)生腸息肉[16]。因此,NLRP3介導IL-18的分泌,可促進腸上皮細胞分化、維持腸上皮完整性并在結腸炎緩解期減少腸上皮細胞的增殖,從而保護結腸炎免于向惡性轉化[17]。最近研究發(fā)現(xiàn)[18]:NLRP3炎性小體除了可以對抗腸炎相關腸癌的發(fā)生,其還可以發(fā)揮抑制結直腸癌遠處轉移的作用;caspase-1缺陷的小鼠更易發(fā)生腸癌肝轉移,并且正是由于NLRP3的缺失而造成。進一步研究發(fā)現(xiàn),NLRP3炎性小體通過增強IL-18介導的NK細胞殺傷腫瘤細胞的功能,從而抑制肝臟中的腸癌轉移灶的生長。

NLRP3與腸道菌群的關系 NLRP3炎性小體與腸道菌群的相關性也在炎性腸病和結直腸腫瘤中逐漸得到證實。Hirota等[19]的研究結果顯示,從Nlrp3_/_小鼠中分離的巨噬細胞對細菌胞壁成分?；谋憩F(xiàn)為無反應,中性粒細胞表現(xiàn)出趨化性降低和自發(fā)性細胞凋亡增加。 此外,Nlrp3_/_小鼠表現(xiàn)出結腸β-防御素表達的改變,抗微生物分泌物的減少和腸道獨特的菌群類型。而NLRP3炎性小體下游細胞因子IL-1β 和IL-18的缺失也被證實與這種對腸道病原菌的抵抗能力下降有關[20]。當NLRP3炎性小體存在時,其通過直接增強IL-1β的分泌來促進局部抗微生物多肽的分泌,從而使腸道微生物群重塑;同時局部的T細胞也在維持腸道穩(wěn)態(tài),對抗其他有害的腸道炎癥中發(fā)揮著重要作用,表現(xiàn)出對結腸炎和結直腸腫瘤很強的抵抗能力[21]。但是,目前仍需要進一步的研究工作來闡明腸道菌群與NLRP3炎性小體在腸道炎癥及結直腸癌中相互作用的信號轉導途徑。

NLRP3的促癌作用 在其他研究中,與報道的NLRP3具有抵抗結直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展功能相反的是:DSS誘導性腸炎在Nlrp3_/_小鼠中卻表現(xiàn)出減弱,并且暴露于DSS時加用caspase-1抑制劑治療可改善結腸炎;這可能因為促炎細胞因子IL-1β、NF-α和IFN-γ的局部減少[22]。NLRP3炎性小體的促癌功能也表現(xiàn)在:巨噬細胞通過NLRP3炎性小體與腫瘤細胞進行細胞間相互作用而增強結直腸癌的侵襲和轉移能力,這可能為結直腸癌發(fā)生肝轉移的機制之一[23]。因此,NLRP3炎性小體在結直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用仍存在一定爭議,需要進一步研究來解釋其功能的多樣性。

NLRP6NLRP6與NLRP3同屬于NLR家族,具有相似的分子結構。目前對于NLRP6炎性小體的研究集中于其在腸道上皮中的保護作用。與NLRP3相似的是,在AOM/DSS結腸癌誘發(fā)模型中,NLRP6缺失型小鼠結腸炎和結腸炎相關性腫瘤的易感性增加[24]。NLRP6可促進caspase-1的激活,增加IL-18的產生,與NLRP3相似。而NLRP6及下游IL8會影響腸道微生物菌群組成結構,NLRP6基因表達缺失可導致腸道的炎癥普雷沃氏菌(Prevotellaceae)和 TM7細菌數(shù)量增加,加重結腸炎癥[25]。進一步研究表明,NLRP6炎性小體不僅通過IL-18在上皮細胞中調節(jié)包括血管生成素-4,內凝集素-1(intelectin-1)和抵抗素樣β分子在內的抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)的轉錄[26],而且也間接下調了IL-22結合蛋白(IL-22BP)的表達,使得IL-22升高以誘導上皮抗菌反應,從而調控結直腸腫瘤的發(fā)生。Muc2黏蛋白是NLRP6炎性小體發(fā)揮作用的另一效應蛋白,是由杯狀細胞產生的大分子糖蛋白,其構成了固有防御系統(tǒng)的第一道防線。Muc2缺失的小鼠會出現(xiàn)自發(fā)性結腸炎,且無法在黏膜表面阻止和清除黏附的病原體[27]。NLRP6炎性小體對Muc2的分泌起到關鍵的調節(jié)作用,其缺乏會導致杯狀細胞無法通過分泌黏液而將細菌排出[28],從而影響腸炎和腸炎相關性腫瘤的發(fā)生。

AIM2

AIM2的炎性小體途徑 黑色素瘤缺乏因子(absent in melanoma 2,AIM2)是一種細胞內DNA感受器,能夠感受到DNA病毒或細菌感染時釋放到細胞質的dsDNA,募集ASC后進而激活caspase-l,促進炎性細胞因子成熟與分泌,形成經典的炎性小體反應[29]。臨床研究已經發(fā)現(xiàn)AIM2的表達與結直腸癌分級呈負相關,其表達缺失與結直腸癌患者的預后不良( 生存時間短、復發(fā)率高、轉移率高) 密切相關,可能成為指示患者預后的標志物之一[30]。而關于AIM2在腫瘤中深入的機制探索,除了上述的炎性小體經典反應途徑,目前還有研究集中于不依賴炎性小體的方式。

AIM2非炎性小體依賴途徑 Wilson研究團隊[31]觀察到Aim2基因缺陷AOM/DSS誘導結直腸癌小鼠模型中出現(xiàn)了比Asc缺陷小鼠更大的腫瘤負荷,Aim2_/_/ApcMin/+的腫瘤負荷也高于ApcMin/+小鼠。進一步研究發(fā)現(xiàn)AIM2的作用不依賴于炎性小體激活和IL-1β,而是AIM2與DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)相互作用并限制其活化。而AIM2的缺失會促進DNA-PK介導的Akt過度活化,從而促進細胞增殖和減少細胞凋亡,導致癌癥的發(fā)生。此外,Man等[32]研究也發(fā)現(xiàn)Aim2缺陷型小鼠結腸腫瘤易感性增加,炎性小體相關細胞因子和其他炎癥介質的產生無顯著改變。他們指出,這種情況下腫瘤的發(fā)生是由于腸道干細胞發(fā)生了不可控增殖,異常Wnt信號轉導在沒有AIM2的情況下增強了干細胞向腫瘤發(fā)育的能力[32]。此外,他們還發(fā)現(xiàn)Aim2缺陷型小鼠在與野生型小鼠合養(yǎng)發(fā)生腸道菌群互換后,合養(yǎng)的AIM2缺陷小鼠比分開飼養(yǎng)的AIM2缺陷小鼠在結腸腫瘤的發(fā)生率和數(shù)量上明顯下降。揭示了結直腸腫瘤發(fā)生可能受到宿主遺傳因素和腸道微生物群共同調控,AIM2表達和有益的腸道微生物群具有預防結直腸腫瘤的潛力。

NLRP1,NLRP12和NLRC4

NLRP1的抑制腫瘤作用 NLRP1炎性小體雖然在各類中首先被描述,但其在人結直腸腫瘤中的研究目前還不夠深入。在動物模型中,Nlrp1b_/_小鼠與野生型小鼠相比,腸道炎癥加重,腫瘤易感性增加,IL-1β和IL-18 水平降低;而在恢復腸道中NLRP1表達后,小鼠腸道腫瘤的生長得到抑制,生存期延長,表明腸道上皮細胞中 NLRP1可通過經典途徑抑制腸道腫瘤形成[33-34]。

NLRP12與結直腸腫瘤 NLRP12可介導經典炎性小體反應,產生IL-1β 和IL-18,但目前對于其在腸道炎癥及腫瘤中的研究集中于不依賴炎性小體的抗炎抑癌作用。在Nlrp12基因缺陷小鼠中,炎性細胞因子、趨化因子和致癌因子的產生增多,結腸炎癥和腫瘤易感性增加,這可能與NLRP12抑制巨噬細胞中的NF-κB和ERK活化的功能缺失相關[35]。進一步研究發(fā)現(xiàn),NLRP12通過與腫瘤壞死因子受體相關因子3(TNF receptor-associated factor 3,TRAF3)和NF-κB 誘導激酶(NF-κB inducing kinase,NIK)的相互作用負性調控非經典NF-κB信號通路,從而調控腸道炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展[36]。

NLRC4的腸道保護作用 NLRC4同樣在腸道中發(fā)揮著保護作用。NLRC4炎性小體在腸道的吞噬細胞中促進成熟IL-1β產生,通過特異性反應清除病原體,保護腸道[37]。其可通過下游caspase-1調節(jié)上皮細胞修復損傷,預防結腸炎相關的腫瘤的形成[38]。

炎性小體與治療干預對炎性小體在腸道炎癥及腫瘤中作用和機制的研究為相關疾病提供了治療途徑。以往已經出現(xiàn)針對炎性小體產物IL-1β和IL-18的藥物,如中和IL-1β的卡納單抗及IL-18結合蛋白用于治療炎癥相關疾病,而直接作用炎性小體的產生有可能獲得更好的治療效果。

NLRP3作為研究較為深入的類型,為治療途徑的首選靶標。新型小分子特異性抑制劑,如MCC950和CY-09已被用于靶向抑制NLRP3激活,并在治療多種炎癥性疾病中發(fā)揮作用[39-40]。近期一項在小鼠模型中的研究使用MCC950治療IBD,在喂服3周后,疾病癥狀得到明顯改善[41]。與抑制caspase-1或阻斷IL-1β受體相比,使用另一NLRP3抑制劑INF39在減輕腸道炎癥性改變方面取得更好的效果,揭示了NLRP3抑制劑在腸道炎癥中的應用價值[42]。另外一項關于穿心蓮內酯(Andrographolide)的研究表明,其通過誘導巨噬細胞中的線粒體自噬,可使NLRP3炎性小體失活,從而在小鼠模型中阻止結腸癌的發(fā)生[43]。相似的是,AMPK激活劑GL-V9通過觸發(fā)細胞中的自噬分解NLRP3炎性小體可以治療結腸炎并且預防結腸炎相關腫瘤的發(fā)生[44]。目前,各種藥物雖在動物模型中取得一定成效,但距離臨床應用還有距離。

結語我們將NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRP6、NLRP12和AIM2調控炎性腸病及結直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展的途徑歸納如下:(1)通過形成的炎性小體改變IL-1β和IL-18等細胞因子分泌而直接影響細胞增殖與凋亡;(2)調節(jié)腸道菌群平衡;(3)影響非炎性小體依賴的信號通路。由此反映出各類炎性小體發(fā)揮作用的機制有相似之處,又有各自獨特的途徑,且同一種炎性小體在結直腸腫瘤中也存在著促進和抑制腫瘤發(fā)生的不同表型。

此外,針對炎性小體的藥物雖在體外和動物模型中正逐步得到開發(fā)應用,但我們不禁思考如何開發(fā)出直接針對炎性小體成分的藥物用于結直腸腫瘤的預防和治療,而不是針對IL-1β等效應分子;針對炎性小體這一固有免疫系統(tǒng)成分的干預,是否會影響到適應性免疫反應？因為炎癥的發(fā)生本身就具有兩面性,如何平衡藥物對炎性小體抑制后對人體的利與弊？隨著對炎性小體在包括結直腸腫瘤在內的各類疾病中的不斷深入研究,期望能開發(fā)出可被臨床應用的相關新藥和治療方法。