何恩銘，田 淼，沈瑞池，任育軍，汪文華

(1.福建省亞熱帶植物研究所/福建省亞熱帶植物生理生化重點實驗室，福建 廈門 361006；2.福建農林大學生命科學學院分子細胞與系統(tǒng)生物學中心，福建 福州 350002)

小葉山葡萄Vitis thunbergiivar.taiwaniana是葡萄科葡萄屬植物，又稱細本山葡萄、小本山葡萄、野葡萄等，主要分布在中國臺灣地區(qū)，是當地傳統(tǒng)中藥材，已被研制成多種保健產品[1]。研究發(fā)現(xiàn)，小葉山葡萄根和莖所含的白黎蘆醇[2]有抗菌[3]、抗炎[4]、抗血栓[5—6]、降脂[7]、保肝[8]、預防心血管疾病[9]、抗癌[10]、抗衰老等功效[11]，還可改善腦神經退化性疾病，具有較強的神經保護作用[12—14]，是一種極具藥用潛力的植物次級代謝產物，市場需求較大。小葉山葡萄的傳統(tǒng)藥用部位是根和莖，葉子大多作為廢棄物處理，造成較大的浪費。小葉山葡萄葉茂盛，葉產量遠大于根產量，且可年年收獲，對葉的生物活性成分進行分析，將葉變廢為寶，可為小葉山葡萄資源的合理利用開辟新途徑。

目前，白藜蘆醇的檢測方法主要有薄層色譜法、紫外分光光度法、毛細管電泳法、熒光光度法、氣相色譜法和高效液相色譜法(HPLC)等[15—17]。高效液相色譜法具有分離效率快、靈敏度高、適用于檢測熱不穩(wěn)定成分等優(yōu)點[17]?，F(xiàn)基于HPLC法對小葉山葡萄葉中白藜蘆醇含量進行測定，以期為小葉山葡萄資源的進一步研究和開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：小葉山葡萄葉采收自福建省亞熱帶植物研究所小葉山葡萄苗圃，將其于60 ℃烘干48 h，粉碎過20目篩備用。

主要儀器：Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters)、UV-9100紫外-可見分光光度計(上海佳勝實驗設備有限公司)、Milli-Q純水機(德國Millipole)、精密電子天平、索式提取器、旋轉蒸發(fā)儀、冷卻浸提裝置、電熱恒溫水浴鍋、萬能粉碎機、烘箱、40目標準篩等。

主要試劑：白藜蘆醇對照品(98%)，購自美國Sigma公司；HPLC測試用甲醇為色譜純，提取白藜蘆醇用的甲醇為化學純，超純水為實驗室制備。

1.2 方法

1.2.1 白藜蘆醇儲備液制備 精密稱取白藜蘆醇標準品5.0 mg，用甲醇溶解，置于25 mL 容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻配成白藜蘆醇儲備液200 μg·mL-1。

1.2.2 供試品溶液制備 精確稱取小葉山葡萄粉末1 g，置于50 mL錐形瓶中，加甲醇30 mL，超聲波(功率150 W，頻率20 kHz)提取15 min，過濾，收集濾液；同法再提取2次，合并提取液，轉移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，過濾即得供試品溶液。

1.2.3 檢測波長確定 分別取適量對照品溶液，用甲醇稀釋至適宜濃度，以對照品溶液作空白對照，用UV-9100紫外-可見分光光度計對白藜蘆醇標準品在200～400 nm波長范圍內全掃描，采樣間隔1 nm，中速，根據掃描吸收峰情況確定白藜蘆醇的檢測波長。

1.2.4 高效液相色譜條件 Waters高效液相色譜儀，色譜柱Hypersil C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)，檢測波長306 nm，流動相甲醇-水(72:28)，流速1 mL·min-1，進樣量10 μL。

1.2.5 白藜蘆醇標準曲線繪制 準確吸取白藜蘆醇對照品儲備液1 mL，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻配成20 μg·mL-1對照品溶液。準確吸取對照品溶液分別以5、10、25、50和100 μL體積進樣，按照1.2.4色譜條件進行測定，記錄色譜圖及峰面積。

1.2.6 白藜蘆醇測定方法學評價 按照1.2.4色譜條件，進行精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、加樣回收率等方法學考察試驗，評價HPLC法測定小葉山葡萄葉中白藜蘆醇含量的效果。

1.2.7 樣品中白藜蘆醇測定 精密量取小葉山葡萄葉的提取溶液樣品10 μL，分別進樣測定峰面積，每份溶液重復進樣3次。用回歸方程計算各樣品中白藜蘆醇含量，結果取平均值，根據標準曲線計算樣品中白藜蘆醇含量。

2 結果與分析

2.1 檢測波長

由波長200～400 nm之間掃描的紫外吸收光譜圖可以看出，白藜蘆醇標準品溶液在306 nm處有強吸收峰，故選用波長306 nm作為白藜蘆醇的檢測波長(圖1)。

2.2 白藜蘆醇標準曲線

按照 1.2.4色譜條件進行測定，記錄色譜圖及峰面積。以樣品含量為橫坐標 x(μg·mL-1)、峰面積y(AU·min-1)為縱坐標，繪制標準曲線(圖2)。用最小二乘法線性回歸得白藜蘆醇回歸方程：y=73.523x+21.564，R2=0.9999。測定結果表明，白藜蘆醇對照品含量在10～200 μg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。

圖1 標準品溶液的紫外吸收光譜圖Fig.1 UV absorption spectrum of the reference standard

圖2 標準曲線Fig.2 The standard curve

2.3 高效液相色譜圖

按照1.2.4色譜條件進行測定，白藜蘆醇對照品和小葉山葡萄葉提取液的HPLC色譜圖如圖3、圖4，二者在試驗采用的色譜條件使白藜蘆醇的出峰時間適中，峰型較好不拖尾，其保留時間為16.25 min。

圖3 白藜蘆醇對照品HPLC色譜圖(tR=16.25 min)Fig.3 HPLC chromatogram of resveratrol control ample(tR=16.25 min)

圖4 小葉山葡萄葉提取液的HPLC色譜圖(tR=16.25 min)Fig.4 HPLC chromatogram of control sample (tR=16.25 min)

2.4 精密度試驗

將1.2.5項配制的20 μg·mL-1小葉山葡萄對照品溶液連續(xù)進樣5 次，每次10 μL，結果如表1。峰面積的RSD(n=5)為0.77 %，表明儀器精密度良好。

2.5 重現(xiàn)性試驗

分別準確稱取5份小葉山葡萄葉樣品粉末，每份1 g，按1.2.2方法提取白藜蘆醇，分別定容至100 mL，將供試品溶液分別進樣20 μL，峰面積測定結果見表 2。峰面積的RSD(n=5)為 0.41%，操作方法的誤差在可接受范圍內，說明該方法的重現(xiàn)性較好。

表 1 精密度試驗結果Table 1 Results of precision test

表2 重現(xiàn)性試驗結果Table 2 Results of reproducibility test

2.6 穩(wěn)定性試驗

準確稱取1 g小葉山葡萄葉樣品粉末，按1.2.2方法提取白藜蘆醇，分別定容至100 mL，于室溫(28 ℃左右)中放置，在2 h、4 h、8 h、12 h、24 h不同時間段，每個時間段進樣一次，每次進樣15 μL，然后分別按優(yōu)化的色譜條件進行測定，計算得到RSD為0.21%(表3)，表明樣品溶液在室溫條件下24 h內能穩(wěn)定保存。

表3 穩(wěn)定性試驗結果Table 3 Results of stability test

2.7 加樣回收率試驗

取5個10 mL容量瓶，每個容量瓶中各加入已經測定含量的小葉山葡萄供試品溶液1 mL，再分別加入0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL白藜蘆醇標準品溶液(濃度20 μg·mL-1)，加甲醇定容至刻度，搖勻后，在2.2的色譜條件下分別進樣，計算平均回收率。由表4可知，回收率的平均值為99.92%，RSD=0.39%，表明此方法回收率良好。

表4 加樣回收率的測定結果Table 4 Determination results of recovery

2.8 樣品中白藜蘆醇的測定

精密量取小葉山葡萄葉的提取溶液樣品10 μL，分別進樣測定峰面積，每份溶液重復進樣3次。用回歸方程計算各樣品中白藜蘆醇的含量，結果取平均值，根據標準曲線計算樣品中白藜蘆醇的含量，測得小葉山葡萄葉中白藜蘆醇含量為956.43 μg·g-1DW。

3 結論

本文建立了一種高效液相色譜法(HPLC)測定小葉山葡萄葉中白藜蘆醇含量的檢測方法。色譜條件：Waters高效液相色譜儀，Hypersil C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動相甲醇-水(72:28)，流速1 mL·min-1，檢測波長306 nm。在上述色譜條件下，白藜蘆醇含量在10～200 μg·mL-1范圍內線性關系良好，相關系數r為0.9999，精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性RSD(n=5)分別為0.77%、0.41%、0.21%；平均加標回收率為99.92%，相對標準偏差為0.39%。該方法線性關系、精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率等均達到分析實驗要求，可用于小葉山葡萄葉中白藜蘆醇的定量和定性分析。