李昌寧,李建宏,姚 拓,*,徐萬(wàn)里,冉 福,張建貴,李 琦

1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,蘭州 730070 2 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州 730070 3 鎮(zhèn)原縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,慶陽(yáng) 745000

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,化學(xué)農(nóng)藥是防治植物土傳病蟲(chóng)害的主力軍,其作用不言而喻,雖然2016—2017年我國(guó)農(nóng)藥用量趨于下降,但總量仍很大[1]。大量農(nóng)藥使用后,大部分主要集中在土壤中進(jìn)行生物降解和轉(zhuǎn)化,這些農(nóng)藥不免污染土壤,影響土壤健康,甚至造成土壤退化。溴甲烷(Methyl bromide)廣泛用于土壤消毒,對(duì)真菌、細(xì)菌、土傳病毒、昆蟲(chóng)、螨類、線蟲(chóng)和嚙齒動(dòng)物以及雜草的防治有所向披靡的作用[2],但溴甲烷過(guò)量殘留不僅消耗臭氧層,而且造成土壤質(zhì)量惡化,影響生態(tài)平衡。根據(jù)《蒙特利爾議定書(shū)》哥本哈根修正案,發(fā)達(dá)國(guó)家于2005年淘汰,發(fā)展中國(guó)家于2015年淘汰,裝運(yùn)前檢疫熏蒸和必要用途豁免除外[3]。

為淘汰溴甲烷,聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署(United Nations Environment Program,UNEP)組織各國(guó)專家成立了“溴甲烷替代技術(shù)選擇委員(Methyl Bromide Technical Options Committee,MBTOC)”,MBTOC對(duì)各種溴甲烷替代產(chǎn)品評(píng)估得出結(jié)論：目前在土壤消毒方面尚無(wú)一種物質(zhì)能夠完全替代溴甲烷,也沒(méi)有一種物質(zhì)能達(dá)到溴甲烷廣譜的應(yīng)用效果,因此溴甲烷仍在各國(guó)被廣泛使用在一些必要用途[4- 5]。在此背景下,評(píng)估溴甲烷對(duì)土壤微生物之影響是一件非常重要的工作。土壤微生物是反映土壤健康狀況最敏感的生物學(xué)指標(biāo)[6],微生物在土壤發(fā)育、環(huán)境凈化及維持生態(tài)平衡[7]等方面發(fā)揮著重要作用,且在農(nóng)藥降解和生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮著核心作用[8]。其群落結(jié)構(gòu)和功能的變化可以間接反映出土壤污染物的嚴(yán)重程度及可持續(xù)發(fā)展[9]。目前溴甲烷的研究主要集中在半衰期以及對(duì)大氣、水體等影響方面,但對(duì)土壤健康以及土壤微生物影響機(jī)制(如真菌和細(xì)菌,革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌會(huì)如何響應(yīng)溴甲烷的脅迫)尚缺乏研究[10-12]。

磷脂脂肪酸(PLFA)分析是一種快速測(cè)定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)常用的方法,根據(jù)不同類群的微生物含有指示性PLFA各異,通過(guò)提取、分離及檢測(cè)這些不同指示性PLFA,可定量反映不同類群微生物的變化,能夠可靠的評(píng)價(jià)微生物群落差異[13- 14]。本文選取農(nóng)田土壤為實(shí)驗(yàn)材料,采用田間試驗(yàn)的方法,系統(tǒng)研究農(nóng)田土壤真菌和細(xì)菌,革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌在溴甲烷脅迫下所產(chǎn)生的響應(yīng),為評(píng)價(jià)溴甲烷對(duì)土壤的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供微生物學(xué)診斷依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)在甘肅省蘭州市紅古區(qū)(36°16′23″N,103°0′38″E)草莓種植地進(jìn)行,該區(qū)年均氣溫7.6℃,全年7月份最熱,1月份最冷,年均降水量327.7—349.9 mm,年蒸發(fā)量1507.8 mm,試驗(yàn)地土壤pH為6.8—7.4,試驗(yàn)地已連續(xù)種植草莓兩年。熏蒸試驗(yàn)在事先搭建的密封小拱棚內(nèi)進(jìn)行,溴甲烷用量為65 g/m2(按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)推薦使用量,溴甲烷純度為98.5%,生產(chǎn)廠家為鄭州星島化工科技有限公司),于2016年3月14日開(kāi)始進(jìn)行熏蒸處理,熏蒸開(kāi)始后,保持拱棚密封72 h,之后揭開(kāi)棚膜通風(fēng),分別于施藥第3天(揭棚膜當(dāng)天)、7天、15天、30天、60天、90天采集土樣(預(yù)實(shí)驗(yàn)表明90天時(shí)溴甲烷的影響完全消失),測(cè)定土壤微生物基礎(chǔ)呼吸、誘導(dǎo)呼吸、微生物量碳、代謝熵(qCO2)、土壤微生物群落結(jié)構(gòu)(PLFA)。對(duì)照地與實(shí)驗(yàn)地在同一地塊,前茬、肥力均相同,中間設(shè)置5 m寬隔離帶,對(duì)照和試驗(yàn)地均設(shè)三次重復(fù),每一試驗(yàn)小區(qū)面積均為3 m×3 m。鑒于土壤中微生物數(shù)量的垂直分布一般是上層大于下層,本試驗(yàn)取0—10 cm土壤,用直徑為3.5 cm的土鉆按照5點(diǎn)法取樣,去除表面植被,最后將土樣混勻,剔除根系和土壤入侵物,運(yùn)用“四分法”選取1 kg土樣裝入無(wú)菌樣品采集袋中,冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室于-80℃超低溫冰箱保存,用于土壤微生物的PLFA分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 土壤微生物呼吸測(cè)定

在實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌操作臺(tái)中將土樣混勻、過(guò)2 mm篩,用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定?；A(chǔ)呼吸參照盧虎的方法[15- 16],具體為：稱取20 g新鮮土樣,調(diào)節(jié)土壤含水量至田間持水量的60%用透氣性良好的紗布將土樣包起來(lái)懸于培養(yǎng)瓶上方,然后吸取0.05 mol/L的NaOH溶液20 mL放入培養(yǎng)瓶中,迅速將培養(yǎng)瓶加蓋密封,于25℃恒溫培養(yǎng)24 h,測(cè)定CO2釋放量,同時(shí)設(shè)一空白處理作為對(duì)照。誘導(dǎo)呼吸的測(cè)定先稱取20.0 g新鮮土壤后往其內(nèi)添加200 mg葡萄糖,其余步驟與基礎(chǔ)呼吸測(cè)定方法相同。

1.2.2土壤微生物生物量碳的測(cè)定采用氯仿熏蒸浸提法[16]

土壤微生物量碳(Soil microbial biomas carbon,SMBC)SMBC測(cè)定計(jì)算公式為：

SMBC (mg/kg)=(EC-EC0)/0.38

式中,EC、EC0分別為熏蒸和未熏蒸土壤浸提液中有機(jī)碳含量,0.38為校正系數(shù)。

1.2.3 土壤微生物代謝熵

土壤微生物代謝熵(qCO2)為土壤微生物呼吸(MR)與土壤微生物生物量碳(MBC)的比值,其計(jì)算公式為：qCO2=MR/MBC[17]。

1.2.4 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的測(cè)定(PLFA測(cè)定)

(1)土壤中脂肪酸的提取方法：土壤中脂肪酸的提取和檢測(cè)主要分為4步,提取、分離、酯化、GC-MS分析[18]。

(2)分析條件：色譜柱：HP—5 MS (Agilent Technologies,Inc；60 m 0.250 mm)。升溫程序?yàn)椋?40℃保留3 min,以4℃/min升溫速率升到190℃,190℃保留1 min,3℃/min升溫速率升到230℃,230℃保留1 min,以2℃/min升溫速率升到250℃,250℃保留1 min,以10℃/min升溫速率升到280℃,280℃保留5 min。以MS Scan模式全掃描,掃描范圍50—500,離子源EI+。磷脂脂肪酸(PLFA)分類結(jié)果見(jiàn)表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差(ANOVA of repeated measurement date)分析,用Microsoft Excel 2010軟件繪圖。

表1 特征磷脂脂肪酸(PLFA)分類

2 結(jié)果與分析

2.1 溴甲烷對(duì)土壤微生物呼吸的影響

溴甲烷的施用對(duì)土壤基礎(chǔ)呼吸產(chǎn)生了明顯的影響,熏蒸處理后,土壤基礎(chǔ)呼吸強(qiáng)度迅速下降,第3天時(shí)(熏蒸完成當(dāng)天),與對(duì)照相比,處理組土壤基礎(chǔ)呼吸強(qiáng)度下降了28.5%,隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),處理組土壤基礎(chǔ)呼吸逐漸恢復(fù),與對(duì)照組差值逐漸降低,但恢復(fù)過(guò)程較為緩慢,到第60天處理組與對(duì)照組相比仍相差1.67%,直到第90天,二者的差值為0.6%,并且差異顯著(P<0.05)(圖1)。誘導(dǎo)呼吸測(cè)定結(jié)果顯示了相似的變化趨勢(shì),在溴甲烷處理后,土壤誘導(dǎo)呼吸被嚴(yán)重抑制,處理組在第7天、第30天,第60天差異不顯著外(P>0.05),其余各天差異顯著(P<0.05)。整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi),處理組的土壤誘導(dǎo)呼吸強(qiáng)度都明顯低于對(duì)照組,且其恢復(fù)過(guò)程比土壤基礎(chǔ)呼吸的恢復(fù)過(guò)程更為緩慢,直到培養(yǎng)期結(jié)束(90天)時(shí),處理組與對(duì)照組相比,土壤誘導(dǎo)呼吸的強(qiáng)度仍相差16.2%(圖2)。

圖1 溴甲烷對(duì)土壤基礎(chǔ)呼吸的影響Fig.1 Effects of methyl bromide on soil basal respiration圖中大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P < 0.01),小寫(xiě)字母表示差異顯著(P < 0.05),數(shù)據(jù)為平均值加減標(biāo)準(zhǔn)誤；CK：對(duì)照,control；T：處理,Treatment

圖2 溴甲烷對(duì)土壤誘導(dǎo)呼吸的影響Fig.2 Effects of methyl bromide on soil induced respiration圖中大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P < 0.01)

2.2 溴甲烷對(duì)土壤微生物量碳的影響

與對(duì)照相比,溴甲烷對(duì)土壤微生物量碳存在抑制作用,且在整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi),抑制作用始終存在,除第7天差異不顯著外(P>0.05),其余各處理差異顯著(P<0.05),在培養(yǎng)至第15天時(shí),微生物量碳下降明顯,之后緩慢回升,且處理時(shí)間越長(zhǎng),與對(duì)照組的差別越小,到第90天時(shí)達(dá)到了5.6%。這說(shuō)明經(jīng)過(guò)溴甲烷熏蒸處理,土壤中的微生物量碳會(huì)下降,隨著時(shí)間延長(zhǎng),微生物量碳開(kāi)始緩慢恢復(fù),直至培養(yǎng)結(jié)束,仍未完全恢復(fù)(圖3)。

2.3 溴甲烷對(duì)土壤微生物代謝熵的影響

微生物代謝熵是指示外界環(huán)境脅迫的指標(biāo)。在培養(yǎng)的第3天和第7天,處理組土壤微生物代謝熵都低于對(duì)照組,其余各天處理組土壤微生物代謝熵都高于對(duì)照組,溴甲烷熏蒸處理顯著增加了土壤微生物代謝熵。但隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),處理組和對(duì)照組的差值逐漸降低,在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)(第90天)任相差5.1%(圖4)。

圖3 溴甲烷對(duì)土壤微生物量碳的影響Fig.3 Effects of methyl bromide on soil microbial biomass carbon

圖4 溴甲烷對(duì)土壤微生物代謝熵的影響 Fig.4 Effects of methyl bromide on metabolic entropy of soil microorganism

2.4 溴甲烷對(duì)土壤細(xì)菌、真菌的影響

溴甲烷對(duì)土壤中細(xì)菌存在抑制作用,整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi),溴甲烷處理土壤后處理組細(xì)菌含量較對(duì)照下降0.64%—8.72%,總體上隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)菌含量表現(xiàn)出逐漸增加趨勢(shì),但其含量一直低于對(duì)照組,直至培養(yǎng)結(jié)束沒(méi)有恢復(fù)到對(duì)照水平(圖5)。在整個(gè)培養(yǎng)階段內(nèi),除第3天外,真菌顯著被抑制,表明真菌對(duì)溴甲烷也同樣敏感,第60天以后真菌含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖6)。

圖5 溴甲烷對(duì)土壤細(xì)菌的影響Fig.5 Effects of methyl bromide on Soil Bacteria

圖6 溴甲烷對(duì)土壤真菌的影響Fig.6 Effects of methyl bromide on soil fungi

2.5 溴甲烷對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

GN整體呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢(shì),第7天開(kāi)始,處理組土壤中GN的數(shù)量低于對(duì)照,整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi),其都被顯著抑制,且沒(méi)有恢復(fù),在第15天時(shí)抑制作用最大,下降12.6%(圖7)。GP從第7天到第60天都被顯著抑制。到培養(yǎng)期結(jié)束,GP的量下降0.26%,GN下降10.42%,說(shuō)明GN的變化具有滯后性(圖8)。土壤中細(xì)菌/真菌(即Bacteria/Fungi,簡(jiǎn)稱B/F)和革蘭氏陰性菌/革蘭氏陽(yáng)性菌(GN/GP)值常用來(lái)評(píng)價(jià)不同處理間土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。B/F在培養(yǎng)過(guò)程中呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì),在培養(yǎng)第60天時(shí)比值最低下降6.29%(圖9)。溴甲烷處理也改變了土壤GN/GP,但對(duì)GN/GP的影響比對(duì)B/F的影響更為顯著(圖10)。

2.6 溴甲烷對(duì)土壤微生物壓力指數(shù)的影響

溴甲烷處理下,土壤微生物壓力指數(shù)顯著提高。除第3天,第60天外,整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)處理組壓力指數(shù)始終高于對(duì)照,說(shuō)明施用溴甲烷后,土壤微生物受到了持續(xù)的外源壓力脅迫,使微生物群落結(jié)構(gòu)的壓力指數(shù)顯著升高(圖11)。

2.7 溴甲烷對(duì)土壤總PLFA的影響

在90天的培養(yǎng)過(guò)程中,處理組土壤微生物總PLFA含量較對(duì)照下降0.54%—6.86%,總體上隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),PLFA表現(xiàn)出從低到高的增長(zhǎng)趨勢(shì),但不同的培養(yǎng)時(shí)間段略有差異,在第60天時(shí),PLFA的值最高,之后呈下降趨勢(shì)。在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),溴甲烷顯著抑制總體PLFA(圖12)。

圖7 溴甲烷對(duì)土壤革蘭氏陰性細(xì)菌的影響Fig.7 Effect of methyl bromide on soil gram-negative bacteria

圖8 溴甲烷對(duì)土壤革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的影響Fig.8 Effects of methyl bromide on soil gram positive bacteria

圖9 溴甲烷對(duì)土壤B/F的影響Fig.9 Effect of methyl bromide on soil B/F

圖10 溴甲烷對(duì)土壤GN/GP的影響Fig.10 Effects of methyl bromide on soil GN/GP

圖11 溴甲烷對(duì)土壤微生物壓力指數(shù)的影響Fig.11 Effects of methyl bromide on soil microbial pressure index

圖12 溴甲烷對(duì)土壤總PLFA的影響Fig.12 Effect of methyl bromide on total PLFA in Soil

3 討論

3.1 溴甲烷對(duì)土壤微生物生態(tài)過(guò)程的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)溴甲烷對(duì)土壤微生物量碳存在抑制作用,在熏蒸處理第15天時(shí),土壤微生物量碳下降至15.7%,此時(shí)微生物量碳下降值最大,且處理時(shí)間越長(zhǎng),與對(duì)照的差別越小?？赡艿脑蚴卿寮淄檠舢a(chǎn)生的蒸汽能同微生物體內(nèi)的巰基結(jié)合,使微生物內(nèi)的多種酶類產(chǎn)生漸逆和不可逆的抑制作用,致使土壤微生物量碳的代謝過(guò)程減弱；截止第90天,仍與對(duì)照相差5.6%,可能是溴甲烷熏蒸產(chǎn)生的蒸汽生成強(qiáng)酸性物質(zhì),使細(xì)胞腫脹腐爛或脫水,細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)沉淀,細(xì)胞中毒死亡,微生物代謝過(guò)程減慢[21]。因此,溴甲烷熏蒸處理能夠顯著降低微生物量碳的含量,張成霞、南志標(biāo)[22]發(fā)現(xiàn)土壤微生物量碳對(duì)環(huán)境變化敏感,能夠較早地指示生態(tài)系統(tǒng)功能之變化,土壤微生物組成及活性改變會(huì)導(dǎo)致微生物固碳能力下降。此外,本研究發(fā)現(xiàn),在90天的培養(yǎng)過(guò)程中,土壤細(xì)菌和真菌的數(shù)量都呈下降趨勢(shì),土壤微生物生存受到脅迫,微生物壓力指數(shù)增大,細(xì)菌和真菌的變化范圍分別為0.64%—8.72%和0.03%—5.61%,且細(xì)菌數(shù)量銳減具有滯后性。表明溴甲烷對(duì)某些敏感的細(xì)菌和真菌存在嚴(yán)重毒害作用,從而導(dǎo)致敏感菌群大量死亡,究其原因,可能是細(xì)菌對(duì)熏蒸劑溴甲烷的敏感性大于真菌,致使細(xì)菌的均勻度和豐富度降低的幅度大于真菌[23]；吳小虎研究表明農(nóng)藥甲霜靈對(duì)土壤微生物總體活性具有抑制作用,但隨著時(shí)間的延長(zhǎng),土壤微生物會(huì)逐漸適應(yīng)脅迫環(huán)境[15]。Tanaka[24]和燕平梅[23]研究表明用熏蒸劑熏蒸土壤后不僅目標(biāo)微生物被抑制,還使非目標(biāo)微生物、尤其細(xì)菌類型受到強(qiáng)烈的抑制,這也與本研究溴甲烷處理后細(xì)菌和真菌都被顯著抑制,其細(xì)菌豐度下降最為明顯具有一定的相似性。本研究還發(fā)現(xiàn)從第15—90天,處理組土壤微生物代謝熵都高于對(duì)照組,在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)(第90天)任相差5.1%,說(shuō)明用溴甲烷熏蒸后,微生物呼吸所消耗碳的比例增大,而用于建造微生物細(xì)胞碳的比例相對(duì)減少,使土壤代謝效率和有機(jī)質(zhì)活性較低,不利于土壤優(yōu)良性狀的保持[25]。故熏蒸劑溴甲烷不僅改變土壤中微生物群落結(jié)構(gòu),還使土壤呼吸作用減弱,其物質(zhì)代謝減慢,降低了微生物碳代謝過(guò)程,影響到土壤生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)程[26- 27]。

3.2 溴甲烷對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GN對(duì)溴甲烷的敏感性強(qiáng)于GP,并且GN的恢復(fù)時(shí)間比GP長(zhǎng),而GP從第7—60天都被顯著抑制。到培養(yǎng)期結(jié)束時(shí),GP下降0.26%,GN下降10.42%,說(shuō)明GN的變化具有滯后性。可能的原因是GN細(xì)胞壁較為復(fù)雜,不僅含有肽聚糖,其細(xì)胞壁外還有由脂多糖、磷脂和脂蛋白等若干種蛋白質(zhì)組成的外膜能夠有效的阻止或減緩有害物質(zhì)或惡劣環(huán)境對(duì)細(xì)胞的迫害,從而保護(hù)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)代謝,而GP細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,只含有90%肽聚糖和10%磷壁酸,其對(duì)抗外界環(huán)境變化的緩沖能力較弱[27]。Li等研究表明,施用溴甲烷對(duì)GN的影響時(shí)間長(zhǎng)于GP,而且可以影響土壤微生物的多樣性[28],這也與本試驗(yàn)的結(jié)果相吻合。另外,本研究發(fā)現(xiàn)GN在第30天后較對(duì)照而言抑制作用逐漸減弱,這是由于是GN對(duì)外界環(huán)境有較強(qiáng)的耐性,在GN適應(yīng)了溴甲烷的熏蒸脅迫后能利用外界的碳源促進(jìn)自身的生長(zhǎng)所致[29],羅瑋等[27]分離的一株GN(銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa)能夠以乙草胺為碳源對(duì)其降解率達(dá)到72%—80%,其他藥物的實(shí)驗(yàn)也得出了相似的結(jié)論,說(shuō)明GN會(huì)利用熏蒸劑溴甲烷為碳源進(jìn)行分解作用,從而刺激GN的生長(zhǎng),此時(shí)表現(xiàn)出豐富度、均勻性和多樣性都呈增長(zhǎng)的趨勢(shì)[30- 31]。

4 結(jié)論

熏蒸劑溴甲烷使土壤微生物基礎(chǔ)呼吸和誘導(dǎo)呼吸受到抑制,土壤微生物量碳含量減少,代謝熵(qCO2)增加,且對(duì)誘導(dǎo)呼吸和微生物量碳的影響更大,具有滯后性。溴甲烷能夠減少PLFA含量,顯著抑制B和F豐度,降低GN和GP的多樣性,使土壤微生物的壓力指數(shù)增加,土壤微生物受到了長(zhǎng)期的、持續(xù)的外源壓力脅迫,但對(duì)GN/GP的影響比對(duì)B/F的影響更為顯著。雖然土壤有自凈能力,但這這一過(guò)程較為緩慢,因此,實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)充分考慮溴甲烷對(duì)土壤微生物帶來(lái)的負(fù)面影響。