羅飛亞， 唐 其，?， 陳淼芬， 程 辟， 周祎聰， 曹登天， 曾建國，， 楊 華，鄭亞杰?

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸藥湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南長沙 410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測試中心，湖南長沙 410128；5.湖南漢森制藥股份有限公司，湖南益陽 413000）

四磨湯最早記載于 《重訂嚴(yán)氏濟(jì)生方》，由木香、檳榔、枳殼、烏藥4味藥組成。揮發(fā)油是該中藥制劑發(fā)揮藥效作用的重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。在改善胃腸功能低下和促進(jìn)胃腸動(dòng)力方面發(fā)揮較好的作用[1-4］，臨床上用于嬰幼兒消化不良、老年人腹部脹氣等癥狀[5-7］，在術(shù)后胃腸功能的恢復(fù)方面療效顯著[8-10］。 馬麗等[11］實(shí)驗(yàn)室模擬四磨湯口服液生產(chǎn)工藝，采用水蒸氣蒸餾法獲得揮發(fā)油，并對(duì)揮發(fā)油成分進(jìn)行GC-MS檢測，但模擬并不能完全真實(shí)反映該制劑在大生產(chǎn)中揮發(fā)性成分的實(shí)際情況。劉令安等[12］對(duì)大量四磨湯口服液進(jìn)行揮發(fā)油提取，并利用GC-MS對(duì)其進(jìn)行分析，但是該方法樣品消耗量大、耗時(shí)長。四磨湯口服液現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并未列入揮發(fā)油的相關(guān)檢測項(xiàng)目，尚不能對(duì)該制劑進(jìn)行全面有效的質(zhì)量控制。這種情況也存在于2015版 《中國藥典》收錄的多個(gè)中藥復(fù)方制劑，如丹紅化瘀口服液、柴胡口服液等[13］。因此開展中藥復(fù)方制劑中揮發(fā)成分的檢測，將極大地促進(jìn)中藥制劑質(zhì)量控制體系的全面提升。

頂空固相微萃取 （HS-SPME）作為一種新興的揮發(fā)性成分萃取和分離技術(shù)，利用膜吸附技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)氣相中揮發(fā)性成分的直接吸附，完全不需要任何萃取溶劑，并能夠最大程度地減少樣品使用量，節(jié)約樣品[14-15］。該技術(shù)與GC-MS聯(lián)用，能夠充分利用GC-MS在揮發(fā)性成分定性分析研究中的高效、靈敏和快速結(jié)構(gòu)解析的特點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合NIST化合物譜庫檢索，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品體系中微量揮發(fā)性成分的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)解析。目前該方法已用于川芎、迎春、石韋等植物的揮發(fā)性成分的分析檢測[16-18］，但在中藥復(fù)方制劑揮發(fā)性成分分析中的應(yīng)用尚不多見。

本研究采用HS-SPME-GC-MS方法開展四磨湯口服液中揮發(fā)性成分的分析檢測及其藥味來源的溯源，以期為促進(jìn)四磨湯口服液的全面質(zhì)量研究和提升其質(zhì)量控制水平提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 GCMS-QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、GC／MS solution色譜工作站和NIST.14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫 （日本島津公司）；固相微萃取裝置、固相微萃取手動(dòng)進(jìn)樣手柄、萃取纖維頭 （灰色、粉色、白色、藍(lán)色）、頂空樣品瓶 （CNW） （上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；YB-1500A型粉碎機(jī) （永康市速鋒工貿(mào)有限公司）；PL203電子天平 [梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司］；Milli-Q Advantage A10超純水制備系統(tǒng) （美國 MILLPORE公司）。

1.2 藥品與試劑 四磨湯口服液 （批號(hào)1709219，10 mL／支），木香、檳榔、烏藥和枳殼藥材，經(jīng)湖南漢森制藥股份有限公司劉愛華高級(jí)工程師鑒定為四磨湯口服液生產(chǎn)投料的藥材飲片，均由湖南漢森制藥股份有限公司提供，且經(jīng)質(zhì)量檢驗(yàn)符合2015年版 《中國藥典》（一部）收錄標(biāo)準(zhǔn)。水為實(shí)驗(yàn)室用Milli-Q超純水系統(tǒng)自制。

2 方法

2.1 固相微萃取樣品前處理 取木香、檳榔、烏藥和枳殼等各單味藥材飲片適量，粉碎后過30目篩，避光陰涼處密封保存。稱取粉碎后的各單味藥材粉末各約7 mg于10 mL頂空樣品瓶中，均勻分布在瓶底，然后加200 μL超純水，放入攪拌子，擰緊瓶蓋，備用。

四磨湯口服液輕搖混勻，去除鋁蓋，吸取口服液0.2 mL于頂空樣品瓶中，放入攪拌子，擰緊瓶蓋，備用。

2.2 萃取纖維頭老化 萃取纖維頭在第1次使用或間隔較長時(shí)間使用時(shí)需要進(jìn)行老化。將萃取纖維頭裝入萃取進(jìn)樣手柄，然后插入氣相色譜儀的氣化室，設(shè)定氣化室溫度為240℃，推出萃取纖維頭，保持30 min后縮回萃取纖維頭，取出萃取進(jìn)樣手柄。

2.3 萃取過程 將樣品瓶置于帶溫控?cái)嚢韫δ艿墓滔辔⑤腿⊙b置上并進(jìn)行固定，先將裝有樣品的頂空樣品瓶在70℃預(yù)熱30 min，再開啟磁力攪拌（400 r／min），然后將萃取進(jìn)樣手柄插入頂空樣品瓶中，推出萃取纖維頭，并確保不與試樣和器壁接觸，使其暴露在樣品上方，保持40 min后縮回萃取纖維頭，取出萃取手柄。

2.4 解吸附過程 將完成萃取過程的萃取進(jìn)樣手柄迅速插入到氣相色譜儀進(jìn)樣口的氣化室內(nèi)，溫度設(shè)定為240℃，推出萃取纖維頭使其暴露在高溫氣化室內(nèi)，熱解析5 min后縮回萃取纖維頭，取出萃取手柄。

2.5 GC-MS條件 CD-WAX色譜柱 （30 m×0.25 mm，0.25 μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；進(jìn)樣口溫度240℃；注入方式無分流；載氣高純He（含有量99.99%）；載氣氣體體積流量0.98 mL／min；程序升溫條件為初始溫度80℃，保持2 min，以4℃／min升至100℃，保持5 min，繼續(xù)以3℃／min升至190℃，保持5 min，再以10℃／min升至240℃，保持5 min，分析檢測時(shí)間共計(jì)50 min。

離子源為EI源；離子源溫度200℃；接口溫度220℃；電離能量70 eV；m／z 45～500；采集時(shí)間50 min。

2.6 揮發(fā)性成分定性 將GC-MS分析獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與計(jì)算機(jī)NIST.14譜庫進(jìn)行比對(duì)分析，綜合參考文獻(xiàn)資料、四磨湯口服液和單味藥材的相關(guān)信息，對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性。

3 結(jié)果與分析

3.1 萃取過程相關(guān)參數(shù)優(yōu)化 為了保證更多揮發(fā)性成分被吸附，并且確保色譜分離過程中色譜峰峰形對(duì)稱、分離度高，本研究對(duì)萃取纖維頭種類和樣品取樣量進(jìn)行優(yōu)化。

3.1.1 萃取纖維頭選擇 固相微萃取纖維頭的不同顏色代表了不同的吸附膜種類，對(duì)揮發(fā)性成分的吸附能力存在較大差異。通過比較對(duì)四磨湯口服液中揮發(fā)性成分的吸附能力，篩選出適合四磨湯口服液中揮發(fā)性成分的萃取纖維頭，見圖1。高含有量成分和低含有量成分均呈現(xiàn)出不同的指紋特征。對(duì)高含有量揮發(fā)性成分，灰色＞粉色≈藍(lán)色＞白色；對(duì)低含有量揮發(fā)成分，灰色＞粉色＞白色＞藍(lán)色；對(duì)強(qiáng)保留的高沸點(diǎn)揮發(fā)性成分，粉色＞灰色＞白色＞藍(lán)色。本研究選取吸附揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量相對(duì)較多，色譜峰強(qiáng)度高、峰形好且分離效果好的灰色萃取纖維頭用于下一步研究。

圖1 不同顏色萃取纖維頭吸附四磨湯口服液揮發(fā)性成分的總離子流圖Fig.1 The total ion chromatograms of volatile components from Simotang Oral Solution by different color extraction fiber heads

3.1.2 取樣量優(yōu)化 按照 “2.1”和 “2.3”項(xiàng)下方法，采用稱樣遞減方式，對(duì)各單味藥和四磨湯口服液的取樣量進(jìn)行優(yōu)化。以檳榔為例，見圖2，當(dāng)樣品量從0.06 g降到0.007 g時(shí)，取樣量約降為原來的10%，但其色譜峰的響應(yīng)值保留了原信號(hào)強(qiáng)度的35%，仍然能達(dá)到×106。與此同時(shí)檳榔總離子流圖譜中色譜峰峰形對(duì)稱，絕大多數(shù)色譜峰分離度能達(dá)到基線分離。采用相同方法，比較了其他單味藥材和四磨湯口服液不同取樣量的GC-MS總離子流圖中色譜峰峰形、色譜強(qiáng)度和色譜峰分離度，選擇它們各自的適宜取樣量，即木香、枳殼、烏藥分別取7 mg，四磨湯口服液取0.2 mL作為本研究使用量。相比于文獻(xiàn) [12］中水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油進(jìn)行檢測，SPME僅需要微量樣品就可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品體系中揮發(fā)性成分的分析檢測。

圖2 不同取樣量檳榔中揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of volatile components in Areca with different sampling amounts

3.2 揮發(fā)性成分解析 采用面積歸一化法對(duì)各積分色譜峰占總峰面積百分比進(jìn)行計(jì)算，再將GCMS獲取的四磨湯口服液中揮發(fā)性成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過NIST.14譜庫檢索和人工仔細(xì)比對(duì)，參考文獻(xiàn)報(bào)道的四磨湯口服液和單味藥材中揮發(fā)性成分研究結(jié)果，共鑒定了四磨湯口服液27個(gè)揮發(fā)性成分中的13個(gè)主要揮發(fā)性成分，見表1，其峰面積總和占總峰面積的91.62%。其中占總峰面積百分比超過1%的揮發(fā)性成分包括反式芳樟醇氧化物（呋喃）等峰面積總和占總峰面積的88.95%。作為揮發(fā)性成分的代表組分，可用于四磨湯口服液的進(jìn)一步質(zhì)量研究。

表1 四磨湯口服液中揮發(fā)性成分鑒定及溯源Tab.1 The identification and traceability of volatile components in Simotang Oral Solution

3.3 揮發(fā)性成分藥材溯源 對(duì)四磨湯口服液生產(chǎn)投料的單味藥材所含揮發(fā)性成分進(jìn)行HS-SPMEGC-MS分析檢測。同時(shí)，通過NIST.14譜庫和文獻(xiàn)對(duì)比，對(duì)單味藥材的GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析鑒定并將結(jié)果與四磨湯口服液中的揮發(fā)性成分進(jìn)行比較，從而對(duì)其中揮發(fā)性成分進(jìn)行溯源分析，實(shí)現(xiàn)該中藥復(fù)方中揮發(fā)性成分的來源歸屬。

表1可得，芳樟醇在4味藥材中均含有；α-松油醇、 （Z， Z， Z） -9， 12， 15-十八碳三烯-1-醇和百里香酚等來自其中3味藥材；且芳樟醇氧化物、（-）香芹酮和順式香葉醇3種揮發(fā)性組分僅在枳殼揮發(fā)性成分中存在。此外，檳榔和木香2味藥材中均含有的香葉基丙酮在四磨湯口服液中未檢測到，而在四磨湯口服液中的香葉醇和山梨酸在4味單味藥材中均未發(fā)現(xiàn)它們對(duì)應(yīng)的揮發(fā)性組分。含有山梨酸可能是由于生產(chǎn)過程中添加的輔料山梨酸鉀在樣品萃取過程中隨水蒸氣蒸發(fā)到頂空樣品瓶氣相部分被吸附所致。

4 討論

目前許多中藥復(fù)方制劑在生產(chǎn)過程中保留了揮發(fā)油或芳香水，但是揮發(fā)性成分檢測在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中體現(xiàn)方式不盡相同，有的在含有量測定項(xiàng)下，有的在鑒別項(xiàng)下，有的并未進(jìn)行檢測。如 《中國藥典》中收錄的小兒感冒口服液在鑒別項(xiàng)利用薄層色譜法對(duì)廣藿香和薄荷中揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測，并利用氣相色譜法對(duì)廣藿香中百秋李醇進(jìn)行含有量測定；藿香正氣口服液的揮發(fā)性性成分僅在鑒別項(xiàng)下檢測紫蘇烯和紫蘇醛；橘紅痰咳液中水蒸氣蒸餾液及薄荷腦，作為揮發(fā)性成分均未在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中進(jìn)行控制[13］?，F(xiàn)行的四磨湯口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在含有量測定項(xiàng)下對(duì)組方單味藥材相關(guān)的特征指標(biāo)成分 （柚皮苷、辛弗林、去甲異波爾定和檳榔堿）進(jìn)行測定，相比之下作為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一的揮發(fā)油未進(jìn)行質(zhì)量控制[19-20］。因此，本研究通過對(duì)四磨湯口服液中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，并對(duì)其藥材來源進(jìn)行追溯，有利于全面提升其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，闡明揮發(fā)性成分來源，并為復(fù)方中藥中揮發(fā)性成分檢測及質(zhì)量研究提供參考。

采用HS-SPME-GC-MS方法檢測和鑒定四磨湯口服液中揮發(fā)性成分，經(jīng)樣品量考察發(fā)現(xiàn)該方法靈敏度高。無論固體單味藥材粉末，還是液體樣品，在較少的樣品取樣量的情況下，質(zhì)譜TIC的信號(hào)響應(yīng)仍能達(dá)到 （0.9～1.2）×107，完全能夠滿足揮發(fā)性成分的定性分析檢測，很大程度上簡化了樣品的前處理過程，能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)方中藥制劑中揮發(fā)油的直接分析檢測，極大地提高了檢測效率。

為了探究研究結(jié)果與文獻(xiàn) [11］存在差異的可能原因，與文獻(xiàn)報(bào)道的單味藥材的GC-MS檢測研究結(jié)果進(jìn)行比較[21-24］，結(jié)果表明本研究結(jié)果具有更好的匹配性，而存在差異的原因可能是藥材批次和來源不同、實(shí)驗(yàn)室用藥材與大生產(chǎn)成品用藥材不一致、亦或樣品前處理方法不同等。