徐仲儒， 阮 旭， 楊 曄，2， 尹登科，2，3?

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012；3.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230012）

隨著生活水平不斷提升，糖尿病作為代謝紊亂性疾病逐漸成為人類健康的嚴(yán)重威脅，它是一種多因素、多靶點(diǎn)的頑疾，發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而迅速升高。在臨床治療過程中通常只能采用保守療法對(duì)病情加以緩解，針對(duì)診斷出的臨床病癥進(jìn)行全面治療是首要方案。糖尿病腎病是糖尿病主要并發(fā)癥，也是造成終末期腎衰竭的罪魁禍?zhǔn)字?，如不及時(shí)治療則會(huì)逐步惡化，并危及患者生命。

Toll樣受體4（TLR4）信號(hào)通路是機(jī)體固有免疫的主要構(gòu)成之一，可通過激活NF-κB信號(hào)通路導(dǎo)致下游炎癥因子釋放、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以及相關(guān)炎癥因子再釋放導(dǎo)致信號(hào)放大等[1］，其中TLR4／NF-κB信號(hào)通路是以脂多糖等為配體的固有免疫信號(hào)傳導(dǎo)途徑。研究表明糖尿病狀態(tài)下胰島素抵抗與該信號(hào)通路存在相關(guān)性[2］，同時(shí)腎小球?yàn)V過功能下降、腎小管重吸收能力不足可能也是由于炎癥反應(yīng)所致[3］，故對(duì)糖尿病狀態(tài)下固有免疫異常狀態(tài)的調(diào)節(jié)與穩(wěn)定是糖尿病整體治療的一個(gè)重要思路[4-5］。

丹參作為傳統(tǒng)活血化瘀中藥，在臨床上廣泛用于治療糖尿病腎病，并取得了較好的效果[6］。近期研究表明，丹參中的脂溶性成分丹參酮可下調(diào)單核巨噬細(xì)胞TLR4／NF-κB信號(hào)通路，從而起到降低炎癥反應(yīng)的作用[7］；水溶性成分丹酚酸B也可減輕缺血性中風(fēng)模型的炎癥反應(yīng)[8］。課題組前期發(fā)現(xiàn)，丹參注射液可改善糖尿病大鼠腎小管結(jié)構(gòu)變化，恢復(fù)腎小管功能[9］，對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞 （NRK-52E）有顯著保護(hù)作用，推測(cè)可能是通過調(diào)節(jié)PI3K／Akt信號(hào)通路所致[10］。本實(shí)驗(yàn)考察丹參注射液對(duì)糖尿病狀態(tài)下腎小管TLR4表達(dá)的影響，從固有免疫與炎癥角度闡述該制劑對(duì)糖尿病腎病的改善作用。

1 材料

大鼠腎小管上皮細(xì)胞 （NRK-52E，中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）。SD大鼠 （體質(zhì)量180～220 g）購自安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（皖）2017-001。丹參注射液 （生藥量1.5 g／mL，批號(hào)1705083，正大青春寶藥業(yè)有限公司）；鹽酸二甲雙胍片 （批號(hào)48180104，上海上藥信誼藥廠有限公司）。高糖高脂飼料 （安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心）；鏈脲佐菌素（美國(guó)Sigma公司，產(chǎn)品編號(hào)LS0130）；四甲基偶氮唑鹽 （北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)1212U054）；TLR4兔抗鼠多克隆抗體 （批號(hào)8730k26）、HRP山羊抗兔抗體 （批號(hào) 2847b43）（美國(guó)Affinity公司）；β-actin鼠源單克隆抗體 （批號(hào)ATQAP1801）、HRP山羊抗鼠抗體 （批號(hào)ATQMA2701，美國(guó)Abbkine公司）；SDS-PAGE凝膠試劑盒 （上海碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)P0012 A）；ECL超敏試劑盒 （美國(guó) Thermo Scientific公司，批號(hào)RF232184 A）；蘇木素 （廣州市欣源貿(mào)易有限公司，批號(hào)20180224）；伊紅 （北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20171123）；PV6000（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)17G87D11）。SCW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái) （蘇州宏瑞凈化科技有限公司）；SPECTRA MAX-190型酶標(biāo)儀 （美國(guó)MDC公司）；倒置生物顯微鏡 （德國(guó)Leica公司）；DYCZ-24DN型垂直電泳儀 （北京六一儀器廠）；Amersham Imager 600型成像儀 （美國(guó)GE公司）。

2 方法

2.1 建模、分組與給藥 40只大鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，取其中30只每天喂養(yǎng)高糖高脂飼料，持續(xù)2周，再腹腔注射鏈脲佐菌素 （50 mg／kg），而普通飼料喂養(yǎng)的大鼠腹腔注射等劑量生理鹽水，然后繼續(xù)用相應(yīng)飼料喂養(yǎng)，1周后，每天測(cè)定大鼠血糖，大于16.7 mol／L時(shí)視為造模成功。對(duì)造模成功的大鼠重新隨機(jī)分為正常組、模型組、二甲雙胍組、丹參注射液組，其中后3組繼續(xù)用高糖高脂飼料喂養(yǎng)，而正常組用普通飼料喂養(yǎng)，每天按時(shí)對(duì)丹參注射液組大鼠腹腔注射丹參注射液 （2 mL／kg），二甲雙胍組大鼠灌胃二甲雙胍溶液 （150 mg／kg），模型組、正常組大鼠腹腔注射等劑量生理鹽水 （2 mL／kg）。給藥6周后處死大鼠，取腎臟置于中性福爾馬林溶液中固定，對(duì)組織進(jìn)行石蠟包埋、切片。

2.2 HE染色 將大鼠腎組織石蠟切片放入二甲苯中脫蠟后在梯度乙醇中水化，先用蘇木素對(duì)細(xì)胞核染色5 min，1%鹽酸乙醇分化30 s后溫水返藍(lán)，再用伊紅復(fù)染30 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。

2.3 免疫組化染色 將大鼠腎組織石蠟切片置于二甲苯中脫蠟，梯度乙醇水化，PBS漂洗3次，121℃下檸檬酸鈉緩沖液中浸泡2 min以修復(fù)表面抗原，室溫下自然冷卻后清洗3次，過氧化物酶阻斷劑室溫下孵育10 min，漂洗3遍，37℃下山羊血清孵育20 min，傾去血清后滴加PV6000一抗，4℃下孵育過夜，TBST漂洗3次，滴加HRP二抗，37℃下孵育20 min，漂洗3次后滴加DAB顯色液顯色5 min，洗去DAB顯色液，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，沖洗返藍(lán)。脫水透化后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.4 高糖環(huán)境下NRK-52E細(xì)胞增殖檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按照5×104／mL細(xì)胞密度接種于96孔板中，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至85%面積，更換無血清培養(yǎng)基同步化24 h，再更換含葡萄糖5.5、10、20、30、40、50、60、70、80 mmol／L的無血清培養(yǎng)基。干預(yù) 24 h后， 加入 20 μL MTT 溶液 （5 mg／mL） 孵育 4 h，吸去上清液，加入 150 μL二甲基亞砜后振搖10 min，在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。

2.5 高糖環(huán)境下NRK-52E細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化，按照5×105／mL細(xì)胞密度配制細(xì)胞懸液，加到6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至單層85%面積后，更換無血清培養(yǎng)基同步化 24 h，再分別更換含葡萄糖 5.5、25、80 mmol／L的DMEM培養(yǎng)基，干預(yù)24 h后清洗細(xì)胞表面，每孔加50 μL裂解液，冰上裂解30 min，刮下細(xì)胞，4℃、12 000 r／min離心10 min，蛋白樣品以4∶1體積加入上樣緩沖液，煮沸5 min后在-20℃下長(zhǎng)期保存。SDS-PAGE電泳采用5%濃縮膠和12%分離膠，按每孔30 μg蛋白量上樣，濃縮膠電壓70 V，分離膠電壓更換為110 V，凝膠以200 mA電流轉(zhuǎn)膜2 h，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后5%脫脂奶粉在37℃下封閉1 h，TBST漂洗3次，TLR4多克隆抗體 （兔源） （1∶800）、β-actin單克隆抗體 （鼠源）（1∶1 000）在4℃下孵育過夜，TBST漂洗3次，HRP標(biāo)記的二抗在37℃下孵育1 h，漂洗3次后ECL顯色液曝光，結(jié)果用Image J軟件解析，得到灰度值。

2.6 丹參注射液對(duì)NRK-52E細(xì)胞的影響考察 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化，按照1×104／孔細(xì)胞密度鋪入96孔板，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至單層細(xì)胞85%面積，更換無血清培養(yǎng)基同步化24 h，隨后正常組更換正常無血清培養(yǎng)基，模型組更換高糖無血清培養(yǎng)基，丹參注射液組更換丹參高糖無血清培養(yǎng)基 （相當(dāng)于 30、 3、 0.3、 0.03 mg／mL原藥材），培養(yǎng)24 h后加入MTT溶液孵育4 h，然后吸去上清，加入150 μL二甲基亞砜振搖均勻，在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。

2.7 丹參注射液對(duì)高糖環(huán)境下NRK-52E細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)的影響考察 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化，均勻鋪于6孔板中，待長(zhǎng)至單層85%面積后更換無血清低糖培養(yǎng)基同步化24 h，同步化結(jié)束后正常組更換正常無血清培養(yǎng)基，模型組更換高糖無血清培養(yǎng)基，丹參注射液組分別更換30、3、0.3、0.03 mg／mL丹參高糖無血清培養(yǎng)基，干預(yù)24 h后提取蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，方法同“2.5” 項(xiàng)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 23.0軟件進(jìn)行處理，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05表示存在顯著差異。

3 結(jié)果

3.1 丹參注射液對(duì)大鼠腎小管的保護(hù)作用 圖1顯示，正常組大鼠腎小管和腎小球形態(tài)清晰；模型組大鼠腎臟出現(xiàn)一定程度的腎小管胞外基質(zhì)堆積和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；二甲雙胍組、丹參注射液組上述癥狀較輕。

圖1 大鼠腎組織HE染色 （×200）Fig.1 HE staining of rat renal tissue （×200）

3.2 丹參注射液對(duì)大鼠腎小管TLR4蛋白表達(dá)的影響 圖2顯示，與正常組比較，模型組TLR4蛋白表達(dá)顯著升高 （P＜0.01）；與模型組比較，丹參注射液組其蛋白表達(dá)顯著下降 （P＜0.01），并與正常組比較無顯著差異 （P＞0.05）。

3.3 葡萄糖對(duì)NRK-52E細(xì)胞增殖和TLR4蛋白表達(dá)的影響 圖3顯示，作用24 h后隨著葡萄糖濃度逐漸升高，細(xì)胞增殖率先升后降，并在其濃度超過 50 mmol／L 時(shí)更顯著 （P＜0.05）。

圖4顯示，葡萄糖濃度為25、80 mmol／L時(shí)，TLR4蛋白表達(dá)顯著升高 （P＜0.05， P＜0.01）。

圖2 丹參注射液對(duì)TLR4蛋白表達(dá)的影響 （×200）Fig.2 Effect of Danshen Injection on TLR4 protein expression （×200）

圖3 葡萄糖對(duì)NRK-52E細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of glucose on NRK-52E cell proliferation

圖4 葡萄糖對(duì)TLR4蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of glucose on TLR4 protein expression

3.4 丹參注射液對(duì)高糖環(huán)境下NRK-52E細(xì)胞增殖的影響 圖5顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞增殖被顯著抑制 （P＜0.05）；與模型組比較，丹參注射液組 （30 mg／mL）可顯著減弱這種抑制作用（P＜0.05）。

圖5 丹參注射液對(duì)高糖環(huán)境下NRK-52E細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of Danshen Injection on NRK-52E cell proliferation under high-glucose environment

3.5 丹參注射液對(duì)高糖環(huán)境下TLR4蛋白表達(dá)的影響 圖6顯示，與正常組比較，模型組TLR4蛋白顯著上調(diào) （P＜0.01）；與模型組比較，丹參注射液組其表達(dá)顯著降低 （P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴性。

4 討論

圖6 丹參注射液對(duì)高糖環(huán)境下TLR4蛋白表達(dá)的影響Fig.6 EffectofDanshen Injection on TLR4 protein expression under high-glucose environment

Toll樣受體作為激活固有免疫的重要信號(hào)通路，在受到配體刺激的情況下可傳遞炎癥信號(hào)，并導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥因子釋放[11］。本實(shí)驗(yàn)探討丹參注射液對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用及對(duì)腎組織Toll樣受體4（TLR4）蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)丹參注射液在體內(nèi)可有效降低大鼠TLR4蛋白表達(dá)，并對(duì)腎組織起到一定程度的保護(hù)作用；在體外可削弱高糖誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞 （NRK-52E）TLR4蛋白表達(dá)，并在一定范圍內(nèi)存在劑量依賴性。由此可知，丹參注射液可有效降低TLR4蛋白表達(dá)，可能是通過下調(diào)TLR4／NF-κB信號(hào)通路來降低其下游相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)，從而起到保護(hù)糖尿病狀態(tài)下大鼠腎小管的作用[12］。

現(xiàn)代糖尿病腎病的機(jī)制研究主要是針對(duì)多元醇代謝通路激活、氧化應(yīng)激[13］、糖基化終末代謝產(chǎn)物堆積[14］、 炎癥反應(yīng)[15-16］等， 其中糖尿病腎病狀態(tài)下炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要原因之一可能是高糖環(huán)境下生成的糖基化終末產(chǎn)物 （AGEs）等配體激活NF-κB信號(hào)通路[17］，造成炎癥因子釋放及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，另外有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖尿病狀態(tài)下TLR4信號(hào)通路激活與熱休克蛋白70、高遷移率族蛋白B1存在正相關(guān)[18-19］。研究顯示，體內(nèi)胰島素抵抗可能與TLR4信號(hào)通路上調(diào)有關(guān)，推測(cè)可能是由于Toll樣受體激活后所釋放的炎癥因子和趨化蛋白等信號(hào)分子誘導(dǎo)所致[20-21］， 同時(shí) TLR4／NF-κB 信號(hào)通路可能作為上游信號(hào)通路來誘發(fā)腎組織氧化應(yīng)激，從而造成糖尿病腎病氧化損傷[22］，表明它在糖尿病腎病發(fā)病過程中起到重要作用，并與多種發(fā)病因素密切相關(guān)。

糖尿病在古籍中被記載為消渴癥，中醫(yī)臨床診斷其以氣虛血虛為始，因虛致瘀而后致病[23］。丹參在中醫(yī)治療糖尿病過程中作為治療血瘀的良藥，被廣泛用于各種復(fù)方中，有實(shí)驗(yàn)證明其中的脂溶性成分丹參酮ⅡA[24］、 水溶性成分丹參素[25］及丹參多糖[26］等具有下調(diào)炎癥相關(guān)信號(hào)通路的作用；相關(guān)臨床研究也表明，丹參輔助治療糖尿病腎病可有效地降低患者蛋白尿水平，相比單用西藥有著更理想的療效[27］。本研究通過闡明丹參注射液治療糖尿病腎病的作用機(jī)制，可為中藥臨床用藥及使用禁忌方面提供一定借鑒。